Embora, em teoria, uma molécula do molde seja suficiente, quantidades consideravelmente maiores de DNA são normalmente utilizadas para uma PCR clássica, por exemplo, até 1 µg de DNA genômico de mamífero e apenas 1 pg de DNA plasmidial. A quantidade ideal depende em grande parte do número de cópias da sequência-alvo, bem como de sua complexidade.
Se for utilizado muito pouco molde, será necessário um aumento correspondente no número de ciclos de amplificação para obter uma quantidade suficiente de produto. Uma polimerase Taq usada na maioria dos experimentos de PCR não possui uma função de correção (atividade de exonuclease 3'-5'); portanto, erros que ocorrem durante a amplificação não podem ser corrigidos. Quanto maior o número de ciclos, mais prevalente será a amplificação de produtos defeituosos. Se, por outro lado, a quantidade de molde for muito alta, a probabilidade de primers se ligarem a outras sequências (não cem por cento complementares), bem como a formação de dímeros de primers, aumentará, o que resultará na amplificação de subprodutos. Em muitos casos, o DNA é isolado de culturas de células ou de microrganismos e posteriormente usado como molde de PCR. Após a purificação, é necessário determinar a concentração do DNA para definir o volume necessário para a configuração da PCR. Embora a eletroforese em gel de agarose possa servir para fornecer uma estimativa, esse método está longe de ser preciso. A espectrofotometria UV-Vis foi estabelecida como o padrão ouro para a quantificação de ácidos nucleicos; esse método direto e, portanto, fácil e rápido, mede a absorbância da amostra a 260 nm, e a concentração é calculada com a ajuda de um fator de conversão.
No entanto, se a concentração de DNA for muito baixa (< 1 µg/mL de dsDNA), ou se estiver contaminada com substâncias que também absorvem na faixa de 260 nm (por exemplo, RNA, proteínas, sais), este método atingirá suas limitações. No caso de concentrações muito baixas, as leituras logo se tornarão imprecisas demais para serem úteis, e as contaminações levarão a uma superestimação (às vezes enorme) do valor real. Nesse caso, a quantificação por fluorescência pode ser uma alternativa. Essa técnica baseia-se no uso de um corante fluorescente que se liga especificamente ao dsDNA; apenas o complexo composto por ácido nucleico e corante é excitado pela luz e, subsequentemente, emitirá luz com um comprimento de onda ligeiramente maior. Nesse caso, a intensidade do sinal fluorescente é proporcional à quantidade de DNA e, para determinar a concentração, ela é avaliada em relação a uma curva padrão. As vantagens desse método residem na especificidade da ligação, que exclui as influências externas introduzidas pela contaminação, bem como na capacidade resultante de detectar concentrações muito baixas de DNA. A adequação de qualquer um dos métodos depende principalmente da concentração e da pureza da amostra; em muitos casos, pode até ser aconselhável aplicar ambos os métodos em paralelo.
Horário de publicação: 30 de novembro de 2022