Chociaż teoretycznie wystarczyłaby jedna cząsteczka matrycy, do klasycznej PCR zazwyczaj używa się znacznie większych ilości DNA, na przykład do 1 µg genomowego DNA ssaków i zaledwie 1 pg DNA plazmidowego. Optymalna ilość zależy w dużej mierze od liczby kopii sekwencji docelowej, a także od jej złożoności.
Jeśli użyto bardzo mało matrycy, konieczne będzie odpowiednie zwiększenie liczby cykli amplifikacji, aby uzyskać wystarczającą ilość produktu. Polimeraza Taq, która jest używana w większości eksperymentów PCR, nie posiada funkcji korekcyjnej (aktywność egzonukleazy 3′-5′); w związku z tym błędy występujące podczas amplifikacji nie mogą zostać skorygowane. Im większa liczba cykli, tym bardziej rozpowszechniona będzie amplifikacja wadliwego produktu. Z drugiej strony, jeśli ilość matrycy jest zbyt duża, prawdopodobieństwo wyżarzania się starterów do innych (nie w stu procentach komplementarnych) sekwencji, a także tworzenia dimerów starterów, wzrośnie, co doprowadzi do amplifikacji produktów ubocznych. W wielu przypadkach DNA jest izolowane z hodowli komórkowych lub z mikroorganizmów, a następnie wykorzystywane jako matryca PCR. Po oczyszczeniu konieczne jest określenie stężenia DNA, aby móc określić objętość wymaganą do konfiguracji PCR. Chociaż elektroforeza w żelu agarozowym może służyć do oszacowania, ta metoda jest daleka od dokładności. Spektrofotometria UV-Vis została uznana za złoty standard w ilościowym oznaczaniu kwasów nukleinowych. Ta bezpośrednia, a zatem łatwa i szybka metoda mierzy absorbancję próbki przy 260 nm, a stężenie oblicza się za pomocą współczynnika konwersji.
Jeśli jednak stężenie DNA jest bardzo niskie (< 1 µg/ml dsDNA) lub jest zanieczyszczone substancjami, które również absorbują w zakresie 260 nm (np. RNA, białko, sole), ta metoda osiągnie swoje ograniczenia. W przypadku bardzo niskich stężeń odczyty wkrótce staną się zbyt niedokładne, aby były użyteczne, a zanieczyszczenia doprowadzą do (czasami ogromnego) przeszacowania rzeczywistej wartości. W takim przypadku alternatywą może być kwantyfikacja przy użyciu fluorescencji. Ta technika opiera się na wykorzystaniu barwnika fluorescencyjnego, który wiąże się specyficznie z dsDNA, tylko kompleks składający się z kwasu nukleinowego i barwnika jest wzbudzany przez światło, a następnie emituje światło o nieco wyższej długości fali. Tutaj intensywność sygnału fluorescencyjnego jest proporcjonalna do ilości DNA, a w celu określenia stężenia jest ona oceniana w odniesieniu do krzywej standardowej. Zalety tej metody opierają się na specyficzności wiązania, która wyklucza wpływy zewnętrzne wprowadzane przez zanieczyszczenie, a także na wynikającej z tego zdolności do wykrywania bardzo niskich stężeń DNA. Przydatność każdej z metod zależy głównie od stężenia i czystości próbki; w wielu przypadkach może być nawet wskazane równoległe stosowanie obu metod.
Czas publikacji: 30-11-2022