ମୋର PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ଆମେ କେତେ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଯୋଡିବା ଉଚିତ?

ଯଦିଓ ତତ୍ତ୍ୱଗତ ଭାବରେ, ଟେମ୍ପଲେଟର ଗୋଟିଏ ଅଣୁ ଯଥେଷ୍ଟ ହେବ, ସାଧାରଣତଃ ଏକ କ୍ଲାସିକ୍ PCR ପାଇଁ ଯଥେଷ୍ଟ ଅଧିକ ପରିମାଣର DNA ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ, ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, 1 µg ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଜିନୋମିକ୍ ସ୍ତନ୍ୟପାୟୀ DNA ଏବଂ 1 pg ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ପ୍ଲାଜମିଡ୍ DNA। ସର୍ବୋତ୍ତମ ପରିମାଣ ଲକ୍ଷ୍ୟ କ୍ରମର କପି ସଂଖ୍ୟା ଏବଂ ଏହାର ଜଟିଳତା ଉପରେ ମୁଖ୍ୟତଃ ନିର୍ଭର କରେ।

ଯଦି ବହୁତ କମ୍ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ, ତେବେ ପର୍ଯ୍ୟାପ୍ତ ପରିମାଣର ଉତ୍ପାଦ ପାଇବା ପାଇଁ ଆମ୍ପ୍ଲିଫିକେସନ୍ ଚକ୍ର ସଂଖ୍ୟାରେ ଅନୁରୂପ ବୃଦ୍ଧି ଆବଶ୍ୟକ ହେବ। ଅଧିକାଂଶ PCR ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ଏକ Taq ପଲିମରେଜ୍ ଏକ ସଂଶୋଧନ କାର୍ଯ୍ୟ (3′-5′ ଏକ୍ସୋନ୍ୟୁକ୍ଲିଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ) ବହନ କରେ ନାହିଁ; ତେଣୁ, ଆମ୍ପ୍ଲିଫିକେସନ୍ ସମୟରେ ଘଟୁଥିବା ତ୍ରୁଟିଗୁଡ଼ିକୁ ସଂଶୋଧନ କରାଯାଇପାରିବ ନାହିଁ। ଚକ୍ର ସଂଖ୍ୟା ଯେତେ ଅଧିକ ହେବ, ତ୍ରୁଟିପୂର୍ଣ୍ଣ ଉତ୍ପାଦର ଆମ୍ପ୍ଲିଫିକେସନ୍ ସେତେ ଅଧିକ ହେବ। ଅନ୍ୟପକ୍ଷରେ, ଯଦି ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ପରିମାଣ ଅତ୍ୟଧିକ ହୁଏ, ତେବେ ପ୍ରାଇମରଗୁଡ଼ିକ ଅନ୍ୟ (ଶତ ପ୍ରତିଶତ ଅନୁପୂରକ ନୁହେଁ) କ୍ରମରେ ଆନିଲ୍ ହେବାର ସମ୍ଭାବନା, ଏବଂ ପ୍ରାଇମର ଡାଇମର୍ ଗଠନ ବୃଦ୍ଧି ପାଇବ, ଯାହା ଫଳରେ ଉପ-ଉତ୍ପାଦଗୁଡ଼ିକର ଆମ୍ପ୍ଲିଫିକେସନ୍ ହେବ। ଅନେକ କ୍ଷେତ୍ରରେ, DNA କୁ କୋଷ ସଂସ୍କୃତି କିମ୍ବା ସୂକ୍ଷ୍ମଜୀବଙ୍କଠାରୁ ପୃଥକ କରାଯାଏ ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ PCR ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଭାବରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ। ଶୁଦ୍ଧିକରଣ ପରେ, PCR ସେଟଅପ୍ ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ ପରିମାଣକୁ ପରିଭାଷିତ କରିବା ପାଇଁ DNA ର ସାନ୍ଦ୍ରତା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବା ଆବଶ୍ୟକ। ଆଗାରୋଜ୍ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଏକ ଆକଳନ ପ୍ରଦାନ କରିବାକୁ କାର୍ଯ୍ୟ କରିପାରେ, ଏହି ପଦ୍ଧତି ସଠିକ୍ ନୁହେଁ। ନ୍ୟୁକ୍ଲିକ୍ ଏସିଡର ପରିମାଣ ନିର୍ଦ୍ଧାରଣ ପାଇଁ UV-Vis ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋଫୋଟୋମେଟ୍ରିକୁ ସ୍ୱର୍ଣ୍ଣ ମାନକ ଭାବରେ ପ୍ରତିଷ୍ଠିତ କରାଯାଇଛି; ଏହି ସିଧାସଳଖ ଏବଂ ତେଣୁ ସହଜ ଏବଂ ଦ୍ରୁତ ପଦ୍ଧତି 260 nm ରେ ନମୁନାର ଅବଶୋଷଣ ମାପ କରେ, ଏବଂ ଏକ ରୂପାନ୍ତର କାରକ ସାହାଯ୍ୟରେ ସାନ୍ଦ୍ରତା ଗଣନା କରାଯାଏ।

ଯଦି DNA ସାନ୍ଦ୍ରତା ବହୁତ କମ୍ ଥାଏ, ତଥାପି (< 1 µg/mL dsDNA), କିମ୍ବା ଯଦି ଏହା 260 nm ପରିସର (ଯଥା RNA, ପ୍ରୋଟିନ୍, ଲବଣ) ରେ ଶୋଷିତ ପଦାର୍ଥ ସହିତ ଦୂଷିତ ହୁଏ, ତେବେ ଏହି ପଦ୍ଧତି ଏହାର ସୀମାରେ ପହଞ୍ଚିଯିବ। ବହୁତ କମ୍ ସାନ୍ଦ୍ରତା କ୍ଷେତ୍ରରେ, ପାଠଗୁଡ଼ିକ ଶୀଘ୍ର ବ୍ୟବହାର ପାଇଁ ଅତ୍ୟଧିକ ଭୁଲ ହୋଇଯିବ, ଏବଂ ପ୍ରଦୂଷଣ ପ୍ରକୃତ ମୂଲ୍ୟର (କେବେକେବେ ପ୍ରଚୁର) ଅତ୍ୟଧିକ ଆକଳନ କରିବ। ଏହି କ୍ଷେତ୍ରରେ, ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ବ୍ୟବହାର କରି ପରିମାଣୀକରଣ ଏକ ବିକଳ୍ପ ଉପସ୍ଥାପନ କରିପାରେ। ଏହି କୌଶଳ ଏକ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ ରଙ୍ଗ ବ୍ୟବହାର ଉପରେ ଆଧାରିତ ଯାହା ବିଶେଷ ଭାବରେ dsDNA ସହିତ ବାନ୍ଧିଥାଏ କେବଳ ନ୍ୟୁକ୍ଲିକ୍ ଏସିଡ୍ ଏବଂ ରଙ୍ଗ ବିଶିଷ୍ଟ ଜଟିଳ ଆଲୋକ ଦ୍ୱାରା ଉତ୍ତେଜିତ ହୁଏ, ଏବଂ ଏହା ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ ଟିକିଏ ଅଧିକ ତରଙ୍ଗଦୈର୍ଘ୍ୟର ଆଲୋକ ନିର୍ଗତ କରିବ। ଏଠାରେ, ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ ସଙ୍କେତର ତୀବ୍ରତା DNA ପରିମାଣ ସହିତ ସମାନୁପାତିକ, ଏବଂ ସାନ୍ଦ୍ରତା ନିର୍ଣ୍ଣୟ ପାଇଁ ଏହାକୁ ଏକ ମାନକ ବକ୍ର ସହିତ ସମ୍ପର୍କିତ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରାଯାଏ। ଏହି ପଦ୍ଧତିର ସୁବିଧା ବନ୍ଧନର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଉପରେ ନିର୍ଭର କରେ, ଯାହା ପ୍ରଦୂଷଣ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରବର୍ତ୍ତିତ ବାହ୍ୟ ପ୍ରଭାବକୁ ବାଦ ଦିଏ, ଏବଂ DNA ର ଅତି କମ ସାନ୍ଦ୍ରତା ଚିହ୍ନଟ କରିବାର ଫଳସ୍ୱରୂପ କ୍ଷମତା ଉପରେ ମଧ୍ୟ ନିର୍ଭର କରେ। ଦୁଇଟି ପଦ୍ଧତିର ଉପଯୁକ୍ତତା ମୁଖ୍ୟତଃ ନମୁନା ସାନ୍ଦ୍ରତା ଏବଂ ଶୁଦ୍ଧତା ଉପରେ ନିର୍ଭର କରେ; ଅନେକ କ୍ଷେତ୍ରରେ ଉଭୟ ପଦ୍ଧତିକୁ ସମାନ୍ତରାଳ ଭାବରେ ପ୍ରୟୋଗ କରିବା ମଧ୍ୟ ପରାମର୍ଶିତ ହୋଇପାରେ।