Hoewel in theorie één molecuul van de template voldoende zou zijn, worden voor een klassieke PCR doorgaans aanzienlijk grotere hoeveelheden DNA gebruikt, bijvoorbeeld tot 1 µg genomisch zoogdier-DNA en slechts 1 pg plasmide-DNA. De optimale hoeveelheid hangt grotendeels af van het aantal kopieën van de doelsequentie en de complexiteit ervan.
Als er zeer weinig template wordt gebruikt, is een overeenkomstige toename van het aantal amplificatiecycli nodig om voldoende product te verkrijgen. Een Taq-polymerase die voor de meeste PCR-experimenten wordt gebruikt, beschikt niet over een correctiefunctie (3'-5'-exonucleaseactiviteit); fouten die tijdens de amplificatie optreden, kunnen dus niet worden gecorrigeerd. Hoe hoger het aantal cycli, hoe vaker het gebrekkige product zal worden geamplificeerd. Als daarentegen de hoeveelheid template te hoog is, neemt de kans toe dat primers aan andere (niet honderd procent complementaire) sequenties hechten, evenals de vorming van primerdimeren, wat resulteert in de amplificatie van bijproducten. In veel gevallen wordt DNA geïsoleerd uit celculturen of micro-organismen en vervolgens gebruikt als PCR-template. Na zuivering is het noodzakelijk om de concentratie van het DNA te bepalen om het benodigde volume voor de PCR-opstelling te kunnen bepalen. Hoewel agarosegelelektroforese kan dienen om een schatting te geven, is deze methode verre van nauwkeurig. UV-Vis-spectrofotometrie is uitgegroeid tot de gouden standaard voor de kwantificering van nucleïnezuren. Deze directe en dus eenvoudige en snelle methode meet de absorptie van het monster bij 260 nm en berekent de concentratie met behulp van een conversiefactor.
Als de DNA-concentratie echter zeer laag is (< 1 µg/ml dsDNA), of als het verontreinigd is met stoffen die ook in het 260 nm-bereik absorberen (bijv. RNA, eiwit, zouten), bereikt deze methode zijn beperkingen. Bij zeer lage concentraties worden de metingen al snel te onnauwkeurig om bruikbaar te zijn, en leiden verontreinigingen tot (soms enorme) overschatting van de werkelijke waarde. In dit geval kan kwantificering met behulp van fluorescentie een alternatief bieden. Deze techniek is gebaseerd op het gebruik van een fluorescerende kleurstof die specifiek bindt aan dsDNA; alleen het complex bestaande uit nucleïnezuur en kleurstof wordt door het licht geëxciteerd en zal vervolgens licht met een iets hogere golflengte uitzenden. De intensiteit van het fluorescentiesignaal is hierbij evenredig met de hoeveelheid DNA, en voor het bepalen van de concentratie wordt het geëvalueerd ten opzichte van een standaardcurve. De voordelen van deze methode liggen in de specificiteit van de binding, waardoor externe invloeden door verontreiniging worden uitgesloten, en in het vermogen om zeer lage DNA-concentraties te detecteren. De geschiktheid van een van beide methoden hangt vooral af van de concentratie en zuiverheid van het monster. In veel gevallen kan het zelfs raadzaam zijn om beide methoden parallel toe te passen.
Plaatsingstijd: 30-11-2022