माझ्या पीसीआर प्रतिक्रियेत आपण किती टेम्पलेट जोडावे?

जरी सिद्धांतानुसार, टेम्पलेटचा एक रेणू पुरेसा असला तरी, क्लासिक पीसीआरसाठी मोठ्या प्रमाणात डीएनए वापरला जातो, उदाहरणार्थ, १ µg पर्यंत जीनोमिक सस्तन प्राण्यांचा डीएनए आणि १ pg इतके कमी प्लाझ्मिड डीएनए. इष्टतम रक्कम मुख्यत्वे लक्ष्य अनुक्रमाच्या प्रतींच्या संख्येवर तसेच त्याच्या जटिलतेवर अवलंबून असते.

जर खूप कमी टेम्पलेट वापरला गेला तर पुरेशा प्रमाणात उत्पादन मिळविण्यासाठी प्रवर्धन चक्रांच्या संख्येत तदनुसार वाढ करणे आवश्यक असेल. बहुतेक पीसीआर प्रयोगांसाठी वापरल्या जाणाऱ्या टॅक पॉलिमरेझमध्ये सुधारणा कार्य (३′-५′ एक्सोन्यूक्लीज अ‍ॅक्टिव्हिटी) नसते; त्यामुळे, प्रवर्धनादरम्यान होणाऱ्या त्रुटी दुरुस्त करता येत नाहीत. चक्रांची संख्या जितकी जास्त असेल तितकेच दोषपूर्ण उत्पादनाचे प्रवर्धन अधिक प्रचलित असेल. दुसरीकडे, जर टेम्पलेटचे प्रमाण खूप जास्त असेल, तर प्राइमर इतर (शंभर टक्के पूरक नसलेल्या) अनुक्रमांमध्ये अॅनिल होण्याची शक्यता तसेच प्राइमर डायमर तयार होण्याची शक्यता वाढेल, ज्यामुळे उप-उत्पादनांचे प्रवर्धन होईल. बर्‍याच प्रकरणांमध्ये, डीएनए सेल कल्चर किंवा सूक्ष्मजीवांपासून वेगळे केले जाते आणि नंतर पीसीआर टेम्पलेट म्हणून वापरले जाते. शुद्धीकरणानंतर, पीसीआर सेटअपसाठी आवश्यक असलेले आकारमान परिभाषित करण्यास सक्षम होण्यासाठी डीएनएची एकाग्रता निश्चित करणे आवश्यक आहे. जरी अ‍ॅगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस अंदाज प्रदान करण्यासाठी काम करू शकते, परंतु ही पद्धत अचूक नाही. न्यूक्लिक अॅसिडच्या परिमाणासाठी यूव्ही-व्हिस स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री हे सुवर्ण मानक म्हणून स्थापित केले गेले आहे; ही थेट आणि म्हणून सोपी आणि जलद पद्धत 260 एनएम वर नमुन्याचे शोषण मोजते आणि एकाग्रता रूपांतरण घटकाच्या मदतीने मोजली जाते.

जर डीएनए सांद्रता खूप कमी असेल (< 1 µg/mL dsDNA), किंवा जर ती 260 nm श्रेणीत शोषून घेणाऱ्या पदार्थांनी दूषित असेल (उदा. RNA, प्रथिने, क्षार), तर ही पद्धत त्याच्या मर्यादा गाठेल. खूप कमी सांद्रतेच्या बाबतीत, वाचन लवकरच वापरासाठी खूप चुकीचे होईल आणि दूषिततेमुळे वास्तविक मूल्याचे (कधीकधी प्रचंड) अतिरेकी मूल्यांकन होईल. या प्रकरणात, फ्लोरोसेन्स वापरून परिमाणीकरण एक पर्याय सादर करू शकते. ही पद्धत फ्लोरोसेंट रंगाच्या वापरावर आधारित आहे जी विशेषतः dsDNA ला बांधते फक्त न्यूक्लिक अॅसिड आणि रंग असलेले कॉम्प्लेक्स प्रकाशाने उत्तेजित होते आणि नंतर ते थोड्या जास्त तरंगलांबीचा प्रकाश उत्सर्जित करेल. येथे, फ्लोरोसेंट सिग्नलची तीव्रता डीएनएच्या प्रमाणाशी प्रमाणात आहे आणि एकाग्रता निश्चित करण्यासाठी त्याचे मूल्यांकन मानक वक्रच्या संबंधात केले जाते. या पद्धतीचे फायदे बंधाच्या विशिष्टतेवर अवलंबून आहेत, जे दूषिततेद्वारे आणलेल्या बाह्य प्रभावांना वगळते, तसेच डीएनएच्या खूप कमी सांद्रता शोधण्याच्या परिणामी क्षमतेवर देखील अवलंबून आहे. दोन्ही पद्धतींची उपयुक्तता प्रामुख्याने नमुना एकाग्रता आणि शुद्धतेवर अवलंबून असते; बऱ्याच प्रकरणांमध्ये दोन्ही पद्धती समांतरपणे लागू करणे देखील उचित ठरू शकते.