സിദ്ധാന്തത്തിൽ, ടെംപ്ലേറ്റിലെ ഒരു തന്മാത്ര മതിയാകുമെങ്കിലും, ഒരു ക്ലാസിക് പിസിആറിന് സാധാരണയായി ഗണ്യമായി വലിയ അളവിൽ ഡിഎൻഎ ഉപയോഗിക്കുന്നു, ഉദാഹരണത്തിന്, 1 µg വരെ ജീനോമിക് സസ്തനി ഡിഎൻഎയും 1 pg വരെ പ്ലാസ്മിഡ് ഡിഎൻഎയും. ഒപ്റ്റിമൽ തുക പ്രധാനമായും ലക്ഷ്യ ശ്രേണിയുടെ പകർപ്പുകളുടെ എണ്ണത്തെയും അതിന്റെ സങ്കീർണ്ണതയെയും ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു.
വളരെ കുറച്ച് ടെംപ്ലേറ്റ് മാത്രമേ ഉപയോഗിക്കുന്നുള്ളൂവെങ്കിൽ, മതിയായ അളവിൽ ഉൽപ്പന്നം ലഭിക്കുന്നതിന് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണത്തിൽ അനുബന്ധമായ വർദ്ധനവ് ആവശ്യമായി വരും. മിക്ക PCR പരീക്ഷണങ്ങൾക്കും ഉപയോഗിക്കുന്ന ഒരു Taq പോളിമറേസിൽ ഒരു തിരുത്തൽ പ്രവർത്തനം (3′-5′ എക്സോണുക്ലീസ് പ്രവർത്തനം) ഇല്ല; അതിനാൽ, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സമയത്ത് സംഭവിക്കുന്ന പിശകുകൾ ശരിയാക്കാൻ കഴിയില്ല. സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം കൂടുന്തോറും, പിഴവുള്ള ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കൂടുതൽ വ്യാപകമാകും. മറുവശത്ത്, ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ അളവ് വളരെ കൂടുതലാണെങ്കിൽ, പ്രൈമറുകൾ മറ്റ് (നൂറു ശതമാനം സൗജന്യമല്ല) സീക്വൻസുകളിലേക്ക് അനീലിംഗ് ചെയ്യാനുള്ള സാധ്യതയും പ്രൈമർ ഡൈമറുകളുടെ രൂപീകരണവും വർദ്ധിക്കും, ഇത് ഉപോൽപ്പന്നങ്ങളുടെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷന് കാരണമാകും. പല കേസുകളിലും, ഡിഎൻഎയെ സെൽ കൾച്ചറുകളിൽ നിന്നോ സൂക്ഷ്മാണുക്കളിൽ നിന്നോ വേർതിരിച്ചെടുക്കുകയും പിന്നീട് ഒരു പിസിആർ ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. ശുദ്ധീകരണത്തിന് ശേഷം, പിസിആർ സജ്ജീകരണത്തിന് ആവശ്യമായ വോളിയം നിർവചിക്കാൻ കഴിയുന്നതിന് ഡിഎൻഎയുടെ സാന്ദ്രത നിർണ്ണയിക്കേണ്ടത് ആവശ്യമാണ്. അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് ഒരു എസ്റ്റിമേറ്റ് നൽകാൻ സഹായിച്ചേക്കാം, പക്ഷേ ഈ രീതി കൃത്യമല്ല. ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളുടെ അളവ് അളക്കുന്നതിനുള്ള സുവർണ്ണ മാനദണ്ഡമായി UV-Vis സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമെട്രി സ്ഥാപിക്കപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു; ഈ നേരിട്ടുള്ളതും അതിനാൽ എളുപ്പവും വേഗത്തിലുള്ളതുമായ രീതി 260 nm-ൽ സാമ്പിളിന്റെ ആഗിരണം അളക്കുന്നു, കൂടാതെ ഒരു പരിവർത്തന ഘടകത്തിന്റെ സഹായത്തോടെ സാന്ദ്രത കണക്കാക്കുന്നു.
എന്നിരുന്നാലും, ഡിഎൻഎ സാന്ദ്രത വളരെ കുറവാണെങ്കിൽ (< 1 µg/mL dsDNA), അല്ലെങ്കിൽ 260 nm ശ്രേണിയിൽ (ഉദാ: RNA, പ്രോട്ടീൻ, ലവണങ്ങൾ) ആഗിരണം ചെയ്യുന്ന വസ്തുക്കളാൽ മലിനമാണെങ്കിൽ, ഈ രീതി അതിന്റെ പരിമിതികളിലെത്തും. വളരെ കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയുടെ കാര്യത്തിൽ, റീഡിംഗുകൾ ഉടൻ തന്നെ ഉപയോഗിക്കാൻ കഴിയാത്തത്ര കൃത്യതയില്ലാത്തതായിത്തീരും, കൂടാതെ മലിനീകരണം യഥാർത്ഥ മൂല്യത്തിന്റെ (ചിലപ്പോൾ വളരെ വലിയ) അമിത വിലയിരുത്തലിലേക്ക് നയിക്കും. ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, ഫ്ലൂറസെൻസ് ഉപയോഗിച്ചുള്ള അളവ് ഒരു ബദൽ അവതരിപ്പിച്ചേക്കാം. ന്യൂക്ലിക് ആസിഡും ഡൈയും അടങ്ങിയ സമുച്ചയം മാത്രം പ്രകാശത്താൽ ഉത്തേജിപ്പിക്കപ്പെടുന്ന dsDNA-യുമായി പ്രത്യേകമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്ന ഒരു ഫ്ലൂറസെന്റ് ഡൈയുടെ ഉപയോഗത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ് ഈ സാങ്കേതികവിദ്യ, തുടർന്ന് അത് അൽപ്പം ഉയർന്ന തരംഗദൈർഘ്യമുള്ള പ്രകാശം പുറപ്പെടുവിക്കും. ഇവിടെ, ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നലിന്റെ തീവ്രത ഡിഎൻഎയുടെ അളവിന് ആനുപാതികമാണ്, കൂടാതെ സാന്ദ്രത നിർണ്ണയിക്കുന്നതിന് ഇത് ഒരു സ്റ്റാൻഡേർഡ് വക്രവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട് വിലയിരുത്തപ്പെടുന്നു. ഈ രീതിയുടെ ഗുണങ്ങൾ ബോണ്ടിന്റെ പ്രത്യേകതയെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു, ഇത് മലിനീകരണം വഴി അവതരിപ്പിക്കുന്ന ബാഹ്യ സ്വാധീനങ്ങളെ ഒഴിവാക്കുന്നു, അതുപോലെ തന്നെ വളരെ കുറഞ്ഞ ഡിഎൻഎ സാന്ദ്രത കണ്ടെത്താനുള്ള ഫലമായുണ്ടാകുന്ന കഴിവിനെയും ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു. രണ്ട് രീതികളുടെയും അനുയോജ്യത പ്രധാനമായും സാമ്പിൾ സാന്ദ്രതയെയും പരിശുദ്ധിയെയും ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു; പല സന്ദർഭങ്ങളിലും രണ്ട് രീതികളും സമാന്തരമായി പ്രയോഗിക്കുന്നത് പോലും ഉചിതമായിരിക്കും.
പോസ്റ്റ് സമയം: നവംബർ-30-2022