Lai gan teorētiski viena matricas molekula būtu pietiekama, klasiskajai PCR parasti tiek izmantots ievērojami lielāks DNS daudzums, piemēram, līdz 1 µg genoma zīdītāju DNS un tikai 1 pg plazmīdas DNS. Optimālais daudzums lielā mērā ir atkarīgs no mērķa secības kopiju skaita, kā arī no tās sarežģītības.
Ja tiek izmantots ļoti maz matrices, būs nepieciešams atbilstošs amplifikācijas ciklu skaita pieaugums, lai iegūtu pietiekamu produkta daudzumu. Taq polimerāzei, ko izmanto lielākajā daļā PCR eksperimentu, nav korekcijas funkcijas (3′-5′ eksonukleāzes aktivitāte); tādēļ amplifikācijas laikā radušās kļūdas nevar labot. Jo lielāks ciklu skaits, jo izplatītāka būs bojāta produkta amplifikācija. No otras puses, ja matrices daudzums ir pārāk liels, palielināsies primeru saistīšanās ar citām (ne simtprocentīgi komplementārām) sekvencēm, kā arī primeru dimēru veidošanās varbūtība, kas novedīs pie blakusproduktu amplifikācijas. Daudzos gadījumos DNS tiek izolēta no šūnu kultūrām vai mikroorganismiem un pēc tam izmantota kā PCR matrice. Pēc attīrīšanas ir jānosaka DNS koncentrācija, lai varētu noteikt PCR iestatīšanai nepieciešamo tilpumu. Lai gan agarozes gela elektroforēze var kalpot, lai sniegtu novērtējumu, šī metode nebūt nav precīza. UV-Vis spektrofotometrija ir noteikta par zelta standartu nukleīnskābju kvantitatīvai noteikšanai; Šī tiešā un tāpēc vienkāršā un ātrā metode mēra parauga absorbciju pie 260 nm, un koncentrāciju aprēķina, izmantojot konversijas koeficientu.
Tomēr, ja DNS koncentrācija ir ļoti zema (< 1 µg/ml dsDNS) vai ja tā ir piesārņota ar vielām, kas absorbē arī 260 nm diapazonā (piemēram, RNS, olbaltumvielas, sāļi), šī metode sasniegs savus ierobežojumus. Ļoti zemu koncentrāciju gadījumā rādījumi drīz kļūs pārāk neprecīzi, lai tos varētu izmantot, un piesārņojums novedīs pie (dažreiz milzīgas) faktiskās vērtības pārvērtēšanas. Šajā gadījumā alternatīva var būt kvantitatīva noteikšana, izmantojot fluorescenci. Šī metode ir balstīta uz fluorescences krāsvielas izmantošanu, kas specifiski saistās ar dsDNS, tikai komplekss, kas sastāv no nukleīnskābes un krāsvielas, tiek ierosināts ar gaismu, un tas pēc tam izstaro nedaudz augstāka viļņa garuma gaismu. Šeit fluorescences signāla intensitāte ir proporcionāla DNS daudzumam, un koncentrācijas noteikšanai tā tiek novērtēta attiecībā pret standarta līkni. Šīs metodes priekšrocības balstās uz saites specifiskumu, kas izslēdz ārējo ietekmi, ko rada piesārņojums, kā arī uz iegūto spēju noteikt ļoti zemas DNS koncentrācijas. Katras metodes piemērotība galvenokārt ir atkarīga no parauga koncentrācijas un tīrības; daudzos gadījumos var būt pat ieteicams abas metodes piemērot paralēli.
Publicēšanas laiks: 2022. gada 30. novembris