Nors teoriškai pakaktų vienos šablono molekulės, klasikinei PGR paprastai naudojami žymiai didesni DNR kiekiai, pavyzdžiui, iki 1 µg genominės žinduolių DNR ir vos 1 pg plazmidinės DNR. Optimalus kiekis labai priklauso nuo tikslinės sekos kopijų skaičiaus, taip pat nuo jos sudėtingumo.
Jei naudojama labai mažai šablono, norint gauti pakankamą produkto kiekį, reikės atitinkamai padidinti amplifikacijos ciklų skaičių. Taq polimerazė, naudojama daugumai PGR eksperimentų, neturi korekcijos funkcijos (3′-5′ egzonukleazės aktyvumas); todėl amplifikacijos metu atsirandančių klaidų ištaisyti negalima. Kuo didesnis ciklų skaičius, tuo labiau paplitusi ydingo produkto amplifikacija. Kita vertus, jei šablono kiekis yra per didelis, padidės pradmenų prisijungimo prie kitų (ne šimtu procentų komplementarių) sekų tikimybė, taip pat pradmenų dimerų susidarymo tikimybė, o tai sukels šalutinių produktų amplifikaciją. Daugeliu atvejų DNR yra išskiriama iš ląstelių kultūrų arba iš mikroorganizmų ir vėliau naudojama kaip PGR šablonas. Po išgryninimo būtina nustatyti DNR koncentraciją, kad būtų galima apibrėžti PGR paruošimui reikalingą tūrį. Nors agarozės gelio elektroforezė gali padėti pateikti įvertinimą, šis metodas toli gražu nėra tikslus. UV-Vis spektrofotometrija buvo pripažinta auksiniu standartu nukleorūgščių kiekybiniam nustatymui; Šis tiesioginis, todėl paprastas ir greitas metodas matuoja mėginio absorbciją esant 260 nm bangos ilgiui, o koncentracija apskaičiuojama naudojant konversijos koeficientą.
Tačiau jei DNR koncentracija yra labai maža (< 1 µg/ml dsDNR) arba jei ji užteršta medžiagomis, kurios taip pat sugeria 260 nm diapazone (pvz., RNR, baltymais, druskomis), šis metodas pasieks savo ribas. Esant labai mažoms koncentracijoms, rodmenys greitai taps pernelyg netikslūs, kad būtų naudingi, o užterštumas lems (kartais didžiulį) tikrosios vertės pervertinimą. Tokiu atveju alternatyva gali būti kiekybinis nustatymas naudojant fluorescenciją. Šis metodas pagrįstas fluorescencinio dažiklio, kuris specifiškai jungiasi prie dsDNR, naudojimu – šviesa sužadina tik kompleksą, kurį sudaro nukleorūgštis ir dažiklis, ir vėliau jis spinduliuoja šiek tiek didesnio bangos ilgio šviesą. Šiuo atveju fluorescencinio signalo intensyvumas yra proporcingas DNR kiekiui, o koncentracijai nustatyti jis įvertinamas pagal standartinę kreivę. Šio metodo pranašumai grindžiami jungties specifiškumu, kuris pašalina išorinę įtaką, kurią sukelia užterštumas, taip pat gebėjimu aptikti labai mažas DNR koncentracijas. Bet kurio metodo tinkamumas daugiausia priklauso nuo mėginio koncentracijos ir grynumo; daugeliu atvejų netgi gali būti patartina taikyti abu metodus lygiagrečiai.
Įrašo laikas: 2022 m. lapkričio 30 d.