Quamquam theoria una molecula formae sufficeret, maiores quantitates DNA typice ad PCR classicam adhibentur, exempli gratia, usque ad 1 µg DNA genomici mammalium et tantum 1 pg DNA plasmidis. Optima quantitas magnopere pendet a numero exemplarium sequentiae destinatae, necnon ab eius complexitate.
Si minima forma adhibeatur, correspondens augmentum numeri cyclorum amplificationis requiretur ut sufficiens producti quantitas obtineatur. Taq polymerasis quae ad plurima experimenta PCR adhibetur functionem correctionis (activitatem exonucleasis 3′-5′) non habet; ergo errores in amplificatione orti corrigi non possunt. Quo maior numerus cyclorum, eo frequentior amplificatio producti vitiosi erit. Si autem quantitas formae nimis alta est, probabilitas primerorum cum aliis sequentiis (non centum pro cento complementariis) coalescendi, necnon formationis dimerorum primerorum, augebitur, quod amplificationem productorum secundariorum efficiet. In multis casibus, DNA ex culturis cellularum vel ex microorganismis separatur et deinde ut forma PCR adhibetur. Post purificationem, necesse est concentrationem DNA determinare ut volumen quod ad apparatum PCR requiritur definire possit. Dum electrophoresis in gel agarose aestimationem praebere potest, haec methodus longe abest ab accurata. Spectrophotometria UV-Vis ut norma aurea ad quantificationem acidorum nucleicorum constituta est; Haec methodus directa et ideo facilis et celeris absorptionem exempli ad 260 nm metitur, et concentratio ope factoris conversionis computatur.
Si autem concentratio DNA perparva est (< 1 µg/mL dsDNA), vel si contaminata est substantiis quae etiam in spatio 260 nm absorbent (e.g. RNA, proteinum, sales), haec methodus ad limites suos perveniet. In casu concentrationum perparvarum, lectiones mox nimis inaccuratae fient ut in usu sint, et contaminationes ad (interdum ingentem) superaestimationem valoris actualis ducent. Hoc in casu, quantificatio utens fluorescentia alternativam praebere potest. Haec ars in usu tincturae fluorescentis nititur quae specifice ad dsDNA ligat; solum complexus acidum nucleicum et tincturam comprehendens a luce excitatur, et deinde lucem paulo altioris longitudinis undae emittet. Hic, intensitas signi fluorescentis proportionalis est quantitati DNA, et ad concentrationem determinandam aestimatur in relatione ad curvam normam. Commoda huius methodi in specificitate vinculi consistunt, quae influxus externos a contaminatione inductos excludit, necnon in facultate resultante ad detegendas concentrationes DNA perparvas. Aptitudo utriusque methodi praecipue a concentratione et puritate exempli pendet; in multis casibus fortasse etiam expedit ut utramque methodum simul adhibere.
Tempus publicationis: XXX Novembris MMXXII