ನನ್ನ PCR ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗೆ ಎಷ್ಟು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಸೇರಿಸಬೇಕು?

ಸಿದ್ಧಾಂತದಲ್ಲಿ, ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಒಂದು ಅಣು ಸಾಕಾಗುತ್ತದೆಯಾದರೂ, ಕ್ಲಾಸಿಕ್ ಪಿಸಿಆರ್‌ಗೆ ಗಣನೀಯವಾಗಿ ದೊಡ್ಡ ಪ್ರಮಾಣದ ಡಿಎನ್‌ಎಗಳನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ, 1 µg ವರೆಗೆ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಸಸ್ತನಿ ಡಿಎನ್‌ಎ ಮತ್ತು 1 ಪುಟದಷ್ಟು ಕಡಿಮೆ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಡಿಎನ್‌ಎ. ಸೂಕ್ತ ಪ್ರಮಾಣವು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಗುರಿ ಅನುಕ್ರಮದ ಪ್ರತಿಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ ಮತ್ತು ಅದರ ಸಂಕೀರ್ಣತೆಯ ಮೇಲೆ ಅವಲಂಬಿತವಾಗಿರುತ್ತದೆ.

ಬಹಳ ಕಡಿಮೆ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿದರೆ, ಸಾಕಷ್ಟು ಪ್ರಮಾಣದ ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು ಪಡೆಯಲು ವರ್ಧನೆ ಚಕ್ರಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿ ಅನುಗುಣವಾದ ಹೆಚ್ಚಳ ಅಗತ್ಯವಾಗಿರುತ್ತದೆ. ಹೆಚ್ಚಿನ PCR ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗೆ ಬಳಸಲಾಗುವ Taq ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ತಿದ್ದುಪಡಿ ಕಾರ್ಯವನ್ನು (3′-5′ ಎಕ್ಸೋನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆ) ಒಳಗೊಂಡಿರುವುದಿಲ್ಲ; ಹೀಗಾಗಿ, ವರ್ಧನೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಸಂಭವಿಸುವ ದೋಷಗಳನ್ನು ಸರಿಪಡಿಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ. ಚಕ್ರಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ ಹೆಚ್ಚಾದಷ್ಟೂ, ದೋಷಪೂರಿತ ಉತ್ಪನ್ನದ ವರ್ಧನೆಯು ಹೆಚ್ಚು ಪ್ರಚಲಿತವಾಗಿರುತ್ತದೆ. ಮತ್ತೊಂದೆಡೆ, ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಪ್ರಮಾಣವು ತುಂಬಾ ಹೆಚ್ಚಿದ್ದರೆ, ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಇತರ (ನೂರು ಪ್ರತಿಶತ ಪೂರಕವಲ್ಲದ) ಅನುಕ್ರಮಗಳಿಗೆ ಅನೀಲಿಂಗ್ ಆಗುವ ಸಂಭವನೀಯತೆ ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್‌ಗಳ ರಚನೆಯು ಹೆಚ್ಚಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಉಪ-ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ವರ್ಧನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. ಅನೇಕ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, DNA ಅನ್ನು ಕೋಶ ಸಂಸ್ಕೃತಿಗಳಿಂದ ಅಥವಾ ಸೂಕ್ಷ್ಮಜೀವಿಗಳಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ತರುವಾಯ PCR ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನಂತೆ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಶುದ್ಧೀಕರಣದ ನಂತರ, PCR ಸೆಟಪ್‌ಗೆ ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಪರಿಮಾಣವನ್ನು ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುವಂತೆ DNA ಯ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುವುದು ಅವಶ್ಯಕ. ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಅಂದಾಜನ್ನು ಒದಗಿಸಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡಬಹುದಾದರೂ, ಈ ವಿಧಾನವು ನಿಖರವಾಗಿಲ್ಲ. ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲಗಳ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣಕ್ಕೆ UV-Vis ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೆಟ್ರಿಯನ್ನು ಚಿನ್ನದ ಮಾನದಂಡವಾಗಿ ಸ್ಥಾಪಿಸಲಾಗಿದೆ; ಈ ನೇರ ಮತ್ತು ಆದ್ದರಿಂದ ಸುಲಭ ಮತ್ತು ತ್ವರಿತ ವಿಧಾನವು 260 nm ನಲ್ಲಿ ಮಾದರಿಯ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಪರಿವರ್ತನಾ ಅಂಶದ ಸಹಾಯದಿಂದ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ.

ಆದಾಗ್ಯೂ, DNA ಸಾಂದ್ರತೆಯು ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆಯಿದ್ದರೆ, (< 1 µg/mL dsDNA), ಅಥವಾ 260 nm ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಲ್ಲಿ (ಉದಾ. RNA, ಪ್ರೋಟೀನ್, ಲವಣಗಳು) ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ವಸ್ತುಗಳಿಂದ ಕಲುಷಿತವಾಗಿದ್ದರೆ, ಈ ವಿಧಾನವು ಅದರ ಮಿತಿಗಳನ್ನು ತಲುಪುತ್ತದೆ. ಬಹಳ ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, ವಾಚನಗೋಷ್ಠಿಗಳು ಶೀಘ್ರದಲ್ಲೇ ಬಳಸಲು ತುಂಬಾ ನಿಖರವಾಗಿಲ್ಲ, ಮತ್ತು ಮಾಲಿನ್ಯಗಳು ನಿಜವಾದ ಮೌಲ್ಯದ (ಕೆಲವೊಮ್ಮೆ ಅಗಾಧವಾದ) ಅತಿಯಾಗಿ ಅಂದಾಜು ಮಾಡಲು ಕಾರಣವಾಗುತ್ತವೆ. ಈ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿದೀಪಕವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವು ಪರ್ಯಾಯವನ್ನು ಪ್ರಸ್ತುತಪಡಿಸಬಹುದು. ಈ ತಂತ್ರವು ಡಿಎಸ್‌ಡಿಎನ್‌ಎಗೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಬಂಧಿಸುವ ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಡೈ ಬಳಕೆಯನ್ನು ಆಧರಿಸಿದೆ, ಇದು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲ ಮತ್ತು ಬಣ್ಣವನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಸಂಕೀರ್ಣವು ಬೆಳಕಿನಿಂದ ಉತ್ಸುಕವಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅದು ತರುವಾಯ ಸ್ವಲ್ಪ ಹೆಚ್ಚಿನ ತರಂಗಾಂತರದ ಬೆಳಕನ್ನು ಹೊರಸೂಸುತ್ತದೆ. ಇಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತದ ತೀವ್ರತೆಯು DNA ಪ್ರಮಾಣಕ್ಕೆ ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಅದನ್ನು ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರರೇಖೆಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದಂತೆ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಈ ವಿಧಾನದ ಅನುಕೂಲಗಳು ಬಂಧದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯ ಮೇಲೆ ನಿಂತಿದೆ, ಇದು ಮಾಲಿನ್ಯದಿಂದ ಪರಿಚಯಿಸಲಾದ ಬಾಹ್ಯ ಪ್ರಭಾವಗಳನ್ನು ಹೊರತುಪಡಿಸುತ್ತದೆ, ಜೊತೆಗೆ DNA ಯ ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯದ ಮೇಲೆ ಅವಲಂಬಿತವಾಗಿರುತ್ತದೆ. ಎರಡೂ ವಿಧಾನಗಳ ಸೂಕ್ತತೆಯು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಮಾದರಿ ಸಾಂದ್ರತೆ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧತೆಯನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿರುತ್ತದೆ; ಅನೇಕ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ ಎರಡೂ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಸಮಾನಾಂತರವಾಗಿ ಅನ್ವಯಿಸುವುದು ಸೂಕ್ತವಾಗಿರುತ್ತದೆ.