כמה תבנית עלינו להוסיף לתגובת ה-PCR שלי?

למרות שבתיאוריה, מולקולה אחת של התבנית תספיק, כמויות גדולות בהרבה של DNA משמשות בדרך כלל עבור PCR קלאסי, לדוגמה, עד 1 מיקרוגרם של DNA גנומי של יונקים ו-1 פיקוגרם בלבד של DNA פלסמיד. הכמות האופטימלית תלויה במידה רבה במספר העותקים של רצף המטרה, כמו גם במורכבותו.

אם משתמשים בתבנית קטנה מאוד, יידרש עלייה מקבילה במספר מחזורי ההגברה כדי לקבל כמות מספקת של מוצר. פולימראז Taq המשמש ברוב ניסויי ה-PCR אינו כולל פונקציית תיקון (פעילות אקסונוקלאז 3'-5'); לכן, לא ניתן לתקן שגיאות המתרחשות במהלך ההגברה. ככל שמספר המחזורים גבוה יותר, כך תהיה ההגברה של מוצר פגום שכיחה יותר. מצד שני, אם כמות התבנית גבוהה מדי, ההסתברות שפריימרים יתחברו לרצפים אחרים (שאינם משלימים במאה אחוז), כמו גם היווצרות דימרים של פריימרים, תגדל, מה שיביא להגברה של תוצרי לוואי. במקרים רבים, DNA מבודד מתרביות תאים או ממיקרואורגניזמים ומשמש לאחר מכן כתבנית PCR. לאחר הטיהור, יש צורך לקבוע את ריכוז ה-DNA כדי להיות מסוגל להגדיר את הנפח הנדרש עבור הגדרת ה-PCR. בעוד שאלקטרופורזה בג'ל אגרוז עשויה לספק הערכה, שיטה זו רחוקה מלהיות מדויקת. ספקטרופוטומטריית UV-Vis נקבעה כסטנדרט הזהב לכימות חומצות גרעין; שיטה ישירה ולכן קלה ומהירה זו מודדת את ספיגת הדגימה ב-260 ננומטר, והריכוז מחושב בעזרת גורם המרה.

אם ריכוז ה-DNA נמוך מאוד (< 1 מיקרוגרם/מ"ל של DNA מסוג dsDNA), או אם הוא מזוהם בחומרים שסופגים גם הם בטווח של 260 ננומטר (למשל RNA, חלבון, מלחים), שיטה זו תגיע למגבלותיה. במקרה של ריכוזים נמוכים מאוד, הקריאות יהפכו במהרה לבלתי מדויקות מכדי להיות שימושיות, וזיהומים יובילו להערכת יתר (לעיתים עצומה) של הערך בפועל. במקרה זה, כימות באמצעות פלואורסצנציה עשוי להוות חלופה. טכניקה זו מבוססת על שימוש בצבע פלואורסצנטי הנקשר באופן ספציפי ל-dsDNA - רק הקומפלקס המורכב מחומצת גרעין וצבע מעורר על ידי האור, ובהמשך הוא יפלוט אור באורך גל מעט גבוה יותר. כאן, עוצמת אות הפלואורסצנציה פרופורציונלית לכמות ה-DNA, ולקביעת הריכוז הוא מוערך ביחס לעקומת תקן. יתרונותיה של שיטה זו נובעים מהספציפיות של הקשר, שאינה כוללת את ההשפעות החיצוניות הנגרמות על ידי זיהום, כמו גם ביכולת הנובעת מזהה ריכוזים נמוכים מאוד של DNA. התאמתן של כל אחת מהשיטות תלויה בעיקר בריכוז הדגימה ובטוהר; במקרים רבים אף מומלץ ליישם את שתי השיטות במקביל.