Meskipun secara teori, satu molekul templat sudah cukup, jumlah DNA yang jauh lebih besar biasanya digunakan untuk PCR klasik, misalnya, hingga 1 µg DNA mamalia genomik dan sesedikit 1 pg DNA plasmid. Jumlah optimal sangat bergantung pada jumlah salinan urutan target, serta kompleksitasnya.
Jika hanya sedikit templat yang digunakan, peningkatan jumlah siklus amplifikasi yang sesuai akan diperlukan untuk memperoleh jumlah produk yang cukup. Polimerase Taq yang digunakan untuk sebagian besar percobaan PCR tidak memiliki fungsi koreksi (aktivitas eksonuklease 3′-5′); dengan demikian, kesalahan yang terjadi selama amplifikasi tidak dapat diperbaiki. Semakin tinggi jumlah siklus, semakin umum amplifikasi produk yang cacat. Sebaliknya, jika jumlah templat terlalu tinggi, kemungkinan primer menempel pada sekuens lain (yang tidak sepenuhnya saling melengkapi), serta pembentukan dimer primer, akan meningkat, yang akan menghasilkan amplifikasi produk sampingan. Dalam banyak kasus, DNA diisolasi dari kultur sel atau dari mikroorganisme dan selanjutnya digunakan sebagai templat PCR. Setelah pemurnian, perlu untuk menentukan konsentrasi DNA agar dapat menentukan volume yang diperlukan untuk pengaturan PCR. Meskipun elektroforesis gel agarosa dapat memberikan perkiraan, metode ini jauh dari akurat. Spektrofotometri UV-Vis telah ditetapkan sebagai standar emas untuk kuantifikasi asam nukleat; metode langsung, mudah, dan cepat ini mengukur absorbansi sampel pada 260 nm, dan konsentrasi dihitung dengan bantuan faktor konversi.
Namun, jika konsentrasi DNA sangat rendah (< 1 µg/mL dsDNA), atau jika terkontaminasi dengan zat yang juga menyerap dalam rentang 260 nm (misalnya RNA, protein, garam), metode ini akan mencapai keterbatasannya. Dalam kasus konsentrasi yang sangat rendah, pembacaan akan segera menjadi terlalu tidak akurat untuk digunakan, dan kontaminasi akan menyebabkan (kadang-kadang sangat besar) perkiraan yang terlalu tinggi dari nilai sebenarnya. Dalam kasus ini, kuantifikasi menggunakan fluoresensi dapat menjadi alternatif. Teknik ini didasarkan pada penggunaan pewarna fluoresensi yang mengikat secara spesifik ke dsDNA, hanya kompleks yang terdiri dari asam nukleat dan pewarna yang tereksitasi oleh cahaya, dan selanjutnya akan memancarkan cahaya dengan panjang gelombang yang sedikit lebih tinggi. Di sini, intensitas sinyal fluoresensi sebanding dengan jumlah DNA, dan untuk menentukan konsentrasinya dievaluasi dalam kaitannya dengan kurva standar. Keuntungan dari metode ini terletak pada spesifisitas ikatan, yang mengecualikan pengaruh eksternal yang disebabkan oleh kontaminasi, serta pada kemampuan yang dihasilkan untuk mendeteksi konsentrasi DNA yang sangat rendah. Kesesuaian salah satu metode terutama bergantung pada konsentrasi dan kemurnian sampel; dalam banyak kasus bahkan mungkin disarankan untuk menerapkan kedua metode secara paralel.
Waktu posting: 30-Nov-2022