Habár elméletileg egyetlen templátmolekula elegendő lenne, a klasszikus PCR-hez jellemzően lényegesen nagyobb mennyiségű DNS-t használnak, például akár 1 µg genomiális emlős DNS-t és akár 1 pg plazmid DNS-t is. Az optimális mennyiség nagymértékben függ a célszekvencia másolatainak számától, valamint annak komplexitásától.
Ha nagyon kevés templátot használunk, az amplifikációs ciklusok számának ennek megfelelő növelésére lesz szükség a megfelelő mennyiségű termék előállításához. A legtöbb PCR-kísérletben használt Taq polimeráz nem rendelkezik korrekciós funkcióval (3′-5′ exonukleáz aktivitás); így az amplifikáció során fellépő hibák nem korrigálhatók. Minél nagyobb a ciklusok száma, annál gyakoribb a hibás termék amplifikációja. Ha viszont a templát mennyisége túl magas, akkor megnő annak a valószínűsége, hogy a primerek más (nem százszázalékosan komplementer) szekvenciákhoz kötődnek, valamint a primer dimerek képződése, ami melléktermékek amplifikációjához vezet. Sok esetben a DNS-t sejtkultúrákból vagy mikroorganizmusokból izolálják, majd PCR-templátként használják. A tisztítást követően meg kell határozni a DNS koncentrációját, hogy meghatározhassuk a PCR-beállításhoz szükséges térfogatot. Bár az agaróz gélelektroforézis becslést adhat, ez a módszer messze nem pontos. Az UV-Vis spektrofotometria a nukleinsavak mennyiségi meghatározásának arany standardjaként ismert; Ez a közvetlen, ezért egyszerű és gyors módszer a minta abszorbanciáját méri 260 nm-en, a koncentrációt pedig egy konverziós tényező segítségével számítja ki.
Ha azonban a DNS-koncentráció nagyon alacsony (< 1 µg/ml dsDNS), vagy ha olyan anyagokkal szennyezett, amelyek a 260 nm-es tartományban is elnyelnek (pl. RNS, fehérje, sók), ez a módszer eléri a korlátait. Nagyon alacsony koncentrációk esetén a leolvasott értékek hamarosan túl pontatlanok lesznek ahhoz, hogy használhatóak legyenek, és a szennyeződések a tényleges érték (néha hatalmas) túlbecsléséhez vezetnek. Ebben az esetben a fluoreszcenciával történő kvantifikáció alternatívát jelenthet. Ez a technika egy olyan fluoreszcens festék használatán alapul, amely specifikusan a dsDNS-hez kötődik, csak a nukleinsavat és a festéket tartalmazó komplexet gerjeszti a fény, és ezt követően valamivel magasabb hullámhosszú fényt bocsát ki. Itt a fluoreszcens jel intenzitása arányos a DNS mennyiségével, és a koncentráció meghatározásához egy standard görbéhez viszonyítva értékelik. A módszer előnyei a kötés specificitásán alapulnak, amely kizárja a szennyeződés által okozott külső hatásokat, valamint a nagyon alacsony DNS-koncentrációk kimutatásának képességén. Bármelyik módszer alkalmassága főként a minta koncentrációjától és tisztaságától függ; sok esetben akár célszerű is lehet mindkét módszert párhuzamosan alkalmazni.
Közzététel ideje: 2022. november 30.