Iako bi teoretski jedna molekula predloška bila dovoljna, za klasični PCR obično se koriste znatno veće količine DNA, na primjer, do 1 µg genomske DNA sisavaca i samo 1 pg plazmidne DNA. Optimalna količina uvelike ovisi o broju kopija ciljne sekvence, kao i o njezinoj složenosti.
Ako se koristi vrlo malo predloška, bit će potrebno odgovarajuće povećanje broja ciklusa amplifikacije kako bi se dobila dovoljna količina produkta. Taq polimeraza koja se koristi za većinu PCR eksperimenata nema funkciju korekcije (3′-5′ egzonukleazna aktivnost); stoga se pogreške koje se javljaju tijekom amplifikacije ne mogu ispraviti. Što je veći broj ciklusa, to će amplifikacija neispravnog produkta biti češća. S druge strane, ako je količina predloška prevelika, povećat će se vjerojatnost vezivanja primera za druge (ne sto posto komplementarne) sekvence, kao i stvaranje dimera primera, što će rezultirati amplifikacijom nusprodukata. U mnogim slučajevima, DNA se izolira iz staničnih kultura ili iz mikroorganizama i potom koristi kao PCR predložak. Nakon pročišćavanja potrebno je odrediti koncentraciju DNA kako bi se mogao definirati volumen potreban za postavljanje PCR-a. Iako elektroforeza na agaroznom gelu može poslužiti za procjenu, ova metoda je daleko od točne. UV-Vis spektrofotometrija uspostavljena je kao zlatni standard za kvantifikaciju nukleinskih kiselina; Ova izravna, a time i jednostavna i brza metoda mjeri apsorbanciju uzorka na 260 nm, a koncentracija se izračunava uz pomoć faktora konverzije.
Ako je koncentracija DNA vrlo niska (< 1 µg/mL dsDNA) ili ako je kontaminirana tvarima koje također apsorbiraju u rasponu od 260 nm (npr. RNA, protein, soli), ova metoda će dosegnuti svoja ograničenja. U slučaju vrlo niskih koncentracija, očitanja će uskoro postati previše netočna da bi bila upotrebljiva, a kontaminacije će dovesti do (ponekad enormnog) precjenjivanja stvarne vrijednosti. U tom slučaju, kvantifikacija pomoću fluorescencije može predstavljati alternativu. Ova tehnika temelji se na upotrebi fluorescentne boje koja se specifično veže na dsDNA - samo kompleks koji sadrži nukleinsku kiselinu i boju pobuđuje se svjetlošću, a on će potom emitirati svjetlost nešto veće valne duljine. Ovdje je intenzitet fluorescentnog signala proporcionalan količini DNA, a za određivanje koncentracije procjenjuje se u odnosu na standardnu krivulju. Prednosti ove metode leže na specifičnosti veze, koja isključuje vanjske utjecaje uzrokovane kontaminacijom, kao i na rezultirajućoj sposobnosti detekcije vrlo niskih koncentracija DNA. Prikladnost bilo koje metode ovisi uglavnom o koncentraciji i čistoći uzorka; u mnogim slučajevima čak može biti preporučljivo primijeniti obje metode paralelno.
Vrijeme objave: 30. studenog 2022.