मुझे अपने पीसीआर रिएक्शन में कितना टेम्पलेट जोड़ना चाहिए?

हालांकि सिद्धांत रूप में, टेम्पलेट का एक अणु पर्याप्त होगा, लेकिन क्लासिक पीसीआर के लिए आमतौर पर डीएनए की काफी बड़ी मात्रा का उपयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, जीनोमिक स्तनधारी डीएनए का 1 µg तक और प्लास्मिड डीएनए का 1 pg जितना कम। इष्टतम मात्रा काफी हद तक लक्ष्य अनुक्रम की प्रतियों की संख्या, साथ ही इसकी जटिलता पर निर्भर करती है।

यदि बहुत कम टेम्पलेट का उपयोग किया जाता है, तो पर्याप्त मात्रा में उत्पाद प्राप्त करने के लिए प्रवर्धन चक्रों की संख्या में इसी तरह की वृद्धि की आवश्यकता होगी। अधिकांश पीसीआर प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले टैक पॉलीमरेज़ में सुधार फ़ंक्शन (3′-5′ एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि) नहीं होता है; इस प्रकार, प्रवर्धन के दौरान होने वाली त्रुटियों को ठीक नहीं किया जा सकता है। चक्रों की संख्या जितनी अधिक होगी, दोषपूर्ण उत्पाद का प्रवर्धन उतना ही अधिक होगा। दूसरी ओर, यदि टेम्पलेट की मात्रा बहुत अधिक है, तो प्राइमर के अन्य (सौ प्रतिशत पूरक नहीं) अनुक्रमों के साथ जुड़ने की संभावना, साथ ही प्राइमर डिमर का निर्माण, बढ़ जाएगा, जिसके परिणामस्वरूप उप-उत्पादों का प्रवर्धन होगा। कई मामलों में, डीएनए को सेल कल्चर या सूक्ष्मजीवों से अलग किया जाता है और बाद में पीसीआर टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जाता है। शुद्धिकरण के बाद, पीसीआर सेटअप के लिए आवश्यक मात्रा को परिभाषित करने में सक्षम होने के लिए डीएनए की सांद्रता निर्धारित करना आवश्यक है। जबकि एगरोज़ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस एक अनुमान प्रदान करने के लिए काम कर सकता है, यह विधि सटीक से बहुत दूर है। यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री को न्यूक्लिक एसिड के परिमाणीकरण के लिए स्वर्ण मानक के रूप में स्थापित किया गया है; यह प्रत्यक्ष और इसलिए आसान और त्वरित विधि 260 एनएम पर नमूने के अवशोषण को मापती है, और रूपांतरण कारक की मदद से सांद्रता की गणना की जाती है।

हालाँकि, यदि डीएनए की सांद्रता बहुत कम है (< 1 µg/mL dsDNA), या यदि यह उन पदार्थों से संदूषित है जो 260 एनएम रेंज में भी अवशोषित होते हैं (जैसे आरएनए, प्रोटीन, लवण), तो यह विधि अपनी सीमाओं तक पहुँच जाएगी। बहुत कम सांद्रता के मामले में, रीडिंग जल्द ही उपयोग के लिए बहुत गलत हो जाएगी, और संदूषण वास्तविक मूल्य के (कभी-कभी बहुत अधिक) अधिक आकलन की ओर ले जाएगा। इस मामले में, प्रतिदीप्ति का उपयोग करके परिमाणीकरण एक विकल्प प्रस्तुत कर सकता है। यह तकनीक एक फ्लोरोसेंट डाई के उपयोग पर आधारित है जो विशेष रूप से dsDNA से बंधती है, केवल न्यूक्लिक एसिड और डाई से युक्त परिसर प्रकाश से उत्तेजित होता है, और यह बाद में थोड़ी अधिक तरंग दैर्ध्य का प्रकाश उत्सर्जित करता है। यहां, फ्लोरोसेंट सिग्नल की तीव्रता डीएनए की मात्रा के समानुपाती होती है इस विधि के लाभ बंधन की विशिष्टता पर निर्भर करते हैं, जो संदूषण द्वारा पेश किए गए बाहरी प्रभावों को बाहर करता है, साथ ही डीएनए की बहुत कम सांद्रता का पता लगाने की परिणामी क्षमता पर भी निर्भर करता है। किसी भी विधि की उपयुक्तता मुख्य रूप से नमूने की सांद्रता और शुद्धता पर निर्भर करती है; कई मामलों में दोनों विधियों को समानांतर रूप से लागू करना भी उचित हो सकता है।