Ged a bhiodh aon mholaciul den teamplaid gu leòr ann am prionnsabal, mar as trice bithear a’ cleachdadh meudan mòran nas motha de DNA airson PCR clasaigeach, mar eisimpleir, suas ri 1 µg de DNA genomic mamalan agus cho beag ri 1 pg de DNA plasmid. Tha an ìre as fheàrr an urra gu ìre mhòr air an àireamh de lethbhric den t-sreath targaid, a bharrachd air cho iom-fhillte ‘s a tha e.
Mura tèid mòran teamplaid a chleachdadh, bidh feum air àrdachadh co-fhreagarrach ann an àireamh nan cearcallan leudachaidh gus meud gu leòr de thoradh fhaighinn. Chan eil gnìomh ceartachaidh aig polymerase Taq a thathas a’ cleachdadh airson a’ mhòr-chuid de dheuchainnean PCR (gnìomhachd exonuclease 3′-5′); mar sin, chan urrainnear mearachdan a thachras rè an leudachaidh a cheartachadh. Mar as àirde an àireamh de chearcallan, ’s ann as cumanta a bhios leudachadh toraidh lochtach. Air an làimh eile, ma tha meud an teamplaid ro àrd, bidh coltachd primers a’ ceangal ri sreathan eile (nach eil ceud sa cheud co-phàirteach), a bharrachd air cruthachadh dimers primer, ag àrdachadh, agus mar thoradh air sin bidh leudachadh fo-thoraidhean. Ann am mòran chùisean, tha DNA air a sgaradh bho chultaran cealla no bho meanbh-fhàs-bheairtean agus air a chleachdadh às deidh sin mar theamplaid PCR. Às deidh glanadh, tha e riatanach dùmhlachd an DNA a dhearbhadh gus a bhith comasach air an tomhas-lìonaidh a tha a dhìth airson suidheachadh PCR a mhìneachadh. Ged a dh’ fhaodadh electrophoresis gel agarose tuairmse a thoirt seachad, tha an dòigh seo fada bho bhith ceart. Chaidh speactrophotometry UV-Vis a stèidheachadh mar an ìre òir airson tomhas searbhagan niuclasach; Bidh an dòigh dhìreach agus mar sin furasta is luath seo a’ tomhas sùghadh an t-sampall aig 260 nm, agus thèid dùmhlachd obrachadh a-mach le cuideachadh bho fhactar tionndaidh.
Ma tha dùmhlachd an DNA glè ìosal, ge-tà (< 1 µg/mL dsDNA), no ma tha e air a thruailleadh le stuthan a bhios cuideachd a’ gabhail a-steach anns an raon 260 nm (me RNA, pròtain, salainn), ruigidh an dòigh seo a chrìochan. Ann an cùis dùmhlachdan glè ìosal, bidh na leughaidhean ro mhì-cheart a dh’ aithghearr airson a bhith feumail, agus bheir truailleadh gu cus-mheasadh (uaireannan mòr) air an fhìor luach. Anns a’ chùis seo, faodaidh tomhas a’ cleachdadh fluorescence roghainn eile a thoirt seachad. Tha an dòigh seo stèidhichte air cleachdadh dath fluorescent a cheanglas gu sònraichte ri dsDNA agus chan eil ach an co-thàthadh anns a bheil searbhag niuclasach agus dath air a bhrosnachadh leis an t-solas, agus às deidh sin bidh e a’ leigeil a-mach solas de thonnan-fada beagan nas àirde. An seo, tha dian an t-soidhne fluorescent co-rèireach ri meud an DNA, agus airson an dùmhlachd a dhearbhadh tha e air a mheasadh a thaobh lùb àbhaisteach. Tha buannachdan an dòigh seo an urra ri sònrachas a’ cheangail, a tha a’ fàgail a-mach na buaidhean bhon taobh a-muigh a thig bho thruailleadh, a bharrachd air a’ chomas a thig às a sin dùmhlachdan glè ìosal de DNA a lorg. Tha freagarrachd gach dòigh an urra gu ìre mhòr air dùmhlachd agus purrachd an t-sampall; ann am mòran chùisean is dòcha gum biodh e eadhon ciallach an dà dhòigh a chleachdadh aig an aon àm.
Àm puist: 30 dhen t-Samhain 2022