Hoewol't yn teory ien molekule fan 'e sjabloan genôch wêze soe, wurde typysk folle gruttere hoemannichten DNA brûkt foar in klassike PCR, bygelyks oant 1 µg genomysk sûchdier-DNA en mar 1 pg plasmide-DNA. De optimale hoemannichte hinget foar in grut part ôf fan it oantal kopyen fan 'e doelsekwinsje, lykas fan 'e kompleksiteit dêrfan.
As der in hiel lyts sjabloan brûkt wurdt, sil in oerienkommende ferheging fan it oantal amplifikaasjesyklusen nedich wêze om in foldwaande hoemannichte produkt te krijen. In Taq-polymerase dy't brûkt wurdt foar de measte PCR-eksperiminten hat gjin korreksjefunksje (3′-5′ eksonuklease-aktiviteit); dêrom kinne flaters dy't foarkomme tidens amplifikaasje net korrizjeare wurde. Hoe heger it oantal syklusen, hoe faker de amplifikaasje fan it gebrekkige produkt sil wêze. As, oan 'e oare kant, de hoemannichte sjabloan te heech is, sil de kâns tanimme dat primers oan oare (net hûndert prosint komplementêre) sekwinsjes annealje, lykas de foarming fan primerdimeren, wat sil resultearje yn 'e amplifikaasje fan byprodukten. Yn in protte gefallen wurdt DNA isolearre út selkultueren of út mikroorganismen en dêrnei brûkt as in PCR-sjabloan. Nei suvering is it needsaaklik om de konsintraasje fan it DNA te bepalen om it folume te definiearjen dat nedich is foar de PCR-opset. Wylst agarosegelelektroforese kin tsjinje om in skatting te jaan, is dizze metoade fier fan akkuraat. UV-Vis-spektrofotometry is fêststeld as de gouden standert foar de kwantifikaasje fan nukleïnesoeren; Dizze direkte en dêrom maklike en rappe metoade mjit de absorbânsje fan it stekproef by 260 nm, en de konsintraasje wurdt berekkene mei help fan in konverzjefaktor.
As de DNA-konsintraasje lykwols tige leech is (< 1 µg/mL dsDNA), of as it fersmoarge is mei stoffen dy't ek yn it 260 nm-berik absorbearje (bygelyks RNA, proteïne, sâlt), sil dizze metoade syn beheiningen berikke. Yn it gefal fan tige lege konsintraasjes sille de mjittingen al gau te ûnkrekt wurde om fan nut te wêzen, en fersmoarging sil liede ta (soms enoarme) oerskatting fan 'e werklike wearde. Yn dit gefal kin kwantifikaasje mei fluoreszinsje in alternatyf biede. Dizze technyk is basearre op it gebrûk fan in fluoreszinte kleurstof dy't spesifyk oan dsDNA bindt; allinich it kompleks dat nukleïnezuur en kleurstof omfettet wurdt oanstutsen troch it ljocht, en it sil dêrnei ljocht fan in wat hegere golflingte útstjoere. Hjir is de yntensiteit fan it fluoreszinte sinjaal evenredich mei de hoemannichte DNA, en foar it bepalen fan 'e konsintraasje wurdt it evaluearre yn relaasje ta in standertkromme. De foardielen fan dizze metoade rêste op 'e spesifisiteit fan' e bân, dy't de eksterne ynfloeden dy't troch fersmoarging yntrodusearre wurde útslút, lykas op it resultearjende fermogen om tige lege konsintraasjes DNA te detektearjen. De geskiktheid fan beide metoaden hinget benammen ôf fan 'e konsintraasje en suverens fan it stekproef; yn in protte gefallen kin it sels oan te rieden wêze om beide metoaden parallel ta te passen.
Pleatsingstiid: 30 novimber 2022