Vaikka teoriassa yksi templaattimolekyyli riittäisi, klassisessa PCR:ssä käytetään tyypillisesti huomattavasti suurempia DNA-määriä, esimerkiksi jopa 1 µg genomista nisäkäs-DNA:ta ja niinkin vähän kuin 1 pg plasmidi-DNA:ta. Optimaalinen määrä riippuu pitkälti kohdesekvenssin kopioiden lukumäärästä sekä sen monimutkaisuudesta.
Jos käytetään hyvin vähän templaattia, monistussyklien määrää on vastaavasti lisättävä riittävän tuotemäärän saamiseksi. Useimmissa PCR-kokeissa käytetyllä Taq-polymeraasilla ei ole korjausfunktiota (3′-5′-eksonukleaasiaktiivisuus), joten monistuksen aikana esiintyviä virheitä ei voida korjata. Mitä suurempi syklien lukumäärä, sitä yleisempää virheellisten tuotteiden monistuminen on. Jos taas templaatin määrä on liian suuri, alukkeiden kiinnittymisen todennäköisyys muihin (ei sataprosenttisesti komplementaarisiin) sekvensseihin sekä alukedimeerien muodostuminen lisääntyvät, mikä johtaa sivutuotteiden monistumiseen. Monissa tapauksissa DNA eristetään soluviljelmistä tai mikro-organismeista ja sitä käytetään myöhemmin PCR-templaattina. Puhdistuksen jälkeen on tarpeen määrittää DNA:n pitoisuus, jotta voidaan määritellä PCR-laitteistoon tarvittava tilavuus. Vaikka agaroosigeelielektroforeesi voi antaa arvion, tämä menetelmä on kaikkea muuta kuin tarkka. UV-Vis-spektrofotometria on vakiintunut kultaiseksi standardiksi nukleiinihappojen kvantifioinnissa; Tämä suora ja siten helppo ja nopea menetelmä mittaa näytteen absorbanssin 260 nm:ssä, ja konsentraatio lasketaan muunnoskertoimen avulla.
Jos DNA-pitoisuus on kuitenkin hyvin alhainen (< 1 µg/ml dsDNA:ta) tai jos se on kontaminoitunut aineilla, jotka absorboivat myös 260 nm:n alueella (esim. RNA, proteiini, suolat), tämä menetelmä saavuttaa rajoituksensa. Hyvin pienten pitoisuuksien tapauksessa lukemista tulee pian liian epätarkkoja ollakseen käyttökelpoisia, ja kontaminaatiot johtavat (joskus valtavaan) todellisen arvon yliarviointiin. Tässä tapauksessa fluoresenssin avulla tapahtuva kvantifiointi voi tarjota vaihtoehdon. Tämä tekniikka perustuu fluoresoivan väriaineen käyttöön, joka sitoutuu spesifisesti dsDNA:han. Vain nukleiinihapon ja väriaineen muodostama kompleksi virittyy valolla, ja se sitten emittoi hieman korkeamman aallonpituuden omaavaa valoa. Tässä fluoresenssisignaalin intensiteetti on verrannollinen DNA:n määrään, ja pitoisuuden määrittämiseksi sitä arvioidaan suhteessa standardikäyrään. Tämän menetelmän edut perustuvat sidoksen spesifisyyteen, joka sulkee pois kontaminaation aiheuttamat ulkoiset vaikutukset, sekä siitä johtuvaan kykyyn havaita erittäin pieniä DNA-pitoisuuksia. Kummankin menetelmän soveltuvuus riippuu pääasiassa näytteen pitoisuudesta ja puhtaudesta; monissa tapauksissa voi olla jopa suositeltavaa soveltaa molempia menetelmiä rinnakkain.
Julkaisun aika: 30.11.2022