I když by teoreticky stačila jedna molekula templátu, pro klasickou PCR se obvykle používá podstatně větší množství DNA, například až 1 µg genomové savčí DNA a pouhý 1 pg plazmidové DNA. Optimální množství závisí do značné míry na počtu kopií cílové sekvence a také na její složitosti.
Pokud se použije velmi málo templátu, bude k získání dostatečného množství produktu zapotřebí odpovídající zvýšení počtu amplifikačních cyklů. Taq polymeráza, která se používá pro většinu PCR experimentů, nemá korekční funkci (3'-5' exonukleázová aktivita), takže chyby vznikající během amplifikace nelze opravit. Čím vyšší je počet cyklů, tím častější bude amplifikace chybného produktu. Pokud je naopak množství templátu příliš vysoké, zvýší se pravděpodobnost navázání primerů na jiné (ne stoprocentně komplementární) sekvence, stejně jako tvorba dimerů primerů, což povede k amplifikaci vedlejších produktů. V mnoha případech se DNA izoluje z buněčných kultur nebo z mikroorganismů a následně se používá jako templát PCR. Po purifikaci je nutné stanovit koncentraci DNA, aby bylo možné definovat objem potřebný pro nastavení PCR. I když elektroforéza na agarózovém gelu může sloužit k odhadu, tato metoda zdaleka není přesná. UV-Vis spektrofotometrie se stala zlatým standardem pro kvantifikaci nukleových kyselin; Tato přímá a proto snadná a rychlá metoda měří absorbanci vzorku při 260 nm a koncentrace se vypočítá pomocí konverzního faktoru.
Pokud je však koncentrace DNA velmi nízká (< 1 µg/ml dsDNA), nebo pokud je kontaminována látkami, které absorbují také v rozsahu 260 nm (např. RNA, protein, soli), dosáhne tato metoda svých omezení. V případě velmi nízkých koncentrací se naměřené hodnoty brzy stanou příliš nepřesnými na to, aby byly použitelné, a kontaminace povedou k (někdy enormnímu) nadhodnocení skutečné hodnoty. V tomto případě může být alternativou kvantifikace pomocí fluorescence. Tato technika je založena na použití fluorescenčního barviva, které se specificky váže na dsDNA – světlem je excitován pouze komplex obsahující nukleovou kyselinu a barvivo, který následně emituje světlo o mírně vyšší vlnové délce. Intenzita fluorescenčního signálu je zde úměrná množství DNA a pro stanovení koncentrace se vyhodnocuje ve vztahu ke standardní křivce. Výhody této metody spočívají ve specificitě vazby, která vylučuje vnější vlivy způsobené kontaminací, a také ve výsledné schopnosti detekovat velmi nízké koncentrace DNA. Vhodnost obou metod závisí hlavně na koncentraci a čistotě vzorku; v mnoha případech může být dokonce vhodné aplikovat obě metody současně.
Čas zveřejnění: 30. listopadu 2022