Ancu s'è in teoria, una molecula di u mudellu saria sufficiente, quantità di DNA assai più grande sò tipicamente aduprate per una PCR classica, per esempiu, finu à 1 µg di DNA genomicu di mammiferi è solu 1 pg di DNA plasmidicu. A quantità ottima dipende in gran parte da u numeru di copie di a sequenza bersagliu, è ancu da a so cumplessità.
Sè si usa pocu mudellu, serà necessariu un aumentu currispundente di u numeru di cicli d'amplificazione per ottene una quantità sufficiente di pruduttu. Una polimerasi Taq chì hè aduprata per a maiò parte di l'esperimenti PCR ùn hà micca una funzione di currezzione (attività esonucleasica 3'-5'); dunque, l'errori chì si verificanu durante l'amplificazione ùn ponu esse curretti. Più altu hè u numeru di cicli, più prevalente serà l'amplificazione di u pruduttu difettu. Sè, invece, a quantità di mudellu hè troppu alta, a probabilità chì i primers si leghinu à altre sequenze (micca cumplementari à centu per centu), è ancu a furmazione di dimeri di primer, aumenteranu, ciò chì darà cum'è risultatu l'amplificazione di sottoprodotti. In parechji casi, u DNA hè isolatu da culture cellulari o da microrganismi è successivamente adupratu cum'è mudellu PCR. Dopu a purificazione, hè necessariu determinà a cuncentrazione di u DNA per pudè definisce u vulume necessariu per a cunfigurazione PCR. Mentre l'elettroforesi in gel d'agarosa pò serve per furnisce una stima, questu metudu hè luntanu da esse precisu. A spettrofotometria UV-Vis hè stata stabilita cum'è u standard d'oru per a quantificazione di l'acidi nucleichi; Stu metudu direttu è dunque faciule è rapidu misura l'assorbanza di u campione à 260 nm, è a cuncentrazione hè calculata cù l'aiutu di un fattore di cunversione.
Tuttavia, se a cuncentrazione di DNA hè assai bassa (< 1 µg/mL dsDNA), o s'ella hè contaminata cù sustanzi chì assorbenu ancu in a gamma di 260 nm (per esempiu, RNA, proteine, sali), questu metudu ghjunghjerà à i so limiti. In u casu di cuncentrazioni assai basse, e letture diventeranu prestu troppu imprecise per esse utili, è e contaminazioni portanu à una sovrastima (qualchì volta enorme) di u valore attuale. In questu casu, a quantificazione cù a fluorescenza pò presentà una alternativa. Questa tecnica hè basata nantu à l'usu di un colorante fluorescente chì si lega specificamente à u dsDNA, solu u cumplessu cumpostu da l'acidu nucleicu è u colorante hè eccitatu da a luce, è emetterà successivamente luce di una lunghezza d'onda ligeramente più alta. Quì, l'intensità di u signale fluorescente hè proporzionale à a quantità di DNA, è per determinà a cuncentrazione hè valutata in relazione à una curva standard. I vantaghji di questu metudu si basanu nantu à a specificità di u ligame, chì esclude l'influenze esterne introdutte da a contaminazione, è ancu nantu à a capacità risultante di rilevà cuncentrazioni assai basse di DNA. L'adeguatezza di qualsiasi metudu dipende principalmente da a cuncentrazione è a purità di u campione; in parechji casi pò ancu esse cunsigliatu d'applicà i dui metudi in parallelu.
Data di publicazione: 30 di nuvembre di u 2022