Въпреки че на теория една молекула от матрицата би била достатъчна, за класическа PCR обикновено се използват значително по-големи количества ДНК, например до 1 µg геномна ДНК от бозайници и едва 1 pg плазмидна ДНК. Оптималното количество зависи до голяма степен от броя на копията на целевата последователност, както и от нейната сложност.
Ако се използва много малко матрица, ще е необходимо съответно увеличение на броя цикли на амплификация, за да се получи достатъчно количество продукт. Taq полимераза, която се използва за повечето PCR експерименти, не притежава коригираща функция (3′-5′ екзонуклеазна активност); следователно грешките, възникващи по време на амплификацията, не могат да бъдат коригирани. Колкото по-голям е броят на циклите, толкова по-често срещана ще бъде амплификацията на дефектен продукт. Ако, от друга страна, количеството на матрицата е твърде високо, вероятността праймерите да се свържат с други (не сто процента комплементарни) последователности, както и образуването на праймерни димери, ще се увеличи, което ще доведе до амплификация на странични продукти. В много случаи ДНК се изолира от клетъчни култури или от микроорганизми и впоследствие се използва като PCR матрица. След пречистване е необходимо да се определи концентрацията на ДНК, за да може да се определи обемът, необходим за PCR настройката. Въпреки че електрофорезата в агарозен гел може да служи за предоставяне на оценка, този метод далеч не е точен. UV-Vis спектрофотометрията е установена като златен стандарт за количествено определяне на нуклеинови киселини; Този директен и следователно лесен и бърз метод измерва абсорбцията на пробата при 260 nm, а концентрацията се изчислява с помощта на коефициент на преобразуване.
Ако обаче концентрацията на ДНК е много ниска (< 1 µg/mL dsDNA) или ако е замърсена с вещества, които също абсорбират в диапазона от 260 nm (напр. РНК, протеин, соли), този метод ще достигне своите ограничения. В случай на много ниски концентрации, показанията скоро ще станат твърде неточни, за да бъдат използвани, а замърсяванията ще доведат до (понякога огромно) надценяване на действителната стойност. В този случай количественото определяне с помощта на флуоресценция може да представлява алтернатива. Тази техника се основава на използването на флуоресцентно багрило, което се свързва специфично с dsDNA - само комплексът, състоящ се от нуклеинова киселина и багрило, се възбужда от светлината и впоследствие ще излъчва светлина с малко по-висока дължина на вълната. Тук интензитетът на флуоресцентния сигнал е пропорционален на количеството ДНК и за определяне на концентрацията се оценява спрямо стандартна крива. Предимствата на този метод се основават на специфичността на връзката, която изключва външните влияния, въведени от замърсяването, както и на получената способност за откриване на много ниски концентрации на ДНК. Пригодността на двата метода зависи главно от концентрацията и чистотата на пробата; В много случаи дори може да е препоръчително да се прилагат и двата метода едновременно.
Време на публикуване: 30 ноември 2022 г.