Нягледзячы на тое, што тэарэтычна адной малекулы матрыцы было б дастаткова, для класічнай ПЦР звычайна выкарыстоўваюцца значна большыя колькасці ДНК, напрыклад, да 1 мкг геномнай ДНК млекакормячых і ўсяго 1 пг плазміднай ДНК. Аптымальная колькасць у значнай ступені залежыць ад колькасці копій мэтавай паслядоўнасці, а таксама ад яе складанасці.
Калі выкарыстоўваецца вельмі мала шаблону, для атрымання дастатковай колькасці прадукту спатрэбіцца адпаведнае павелічэнне колькасці цыклаў ампліфікацыі. Taq-палімераза, якая выкарыстоўваецца для большасці эксперыментаў ПЦР, не мае карэкцыйнай функцыі (3′-5′ экзонуклеазная актыўнасць); такім чынам, памылкі, якія ўзнікаюць падчас ампліфікацыі, немагчыма выправіць. Чым большая колькасць цыклаў, тым больш распаўсюджанай будзе ампліфікацыя дэфектнага прадукту. З іншага боку, калі колькасць шаблону занадта вялікая, верагоднасць адпалу праймераў да іншых (не на сто працэнтаў камплементарных) паслядоўнасцей, а таксама ўтварэння дымераў праймераў, павялічыцца, што прывядзе да ампліфікацыі пабочных прадуктаў. У многіх выпадках ДНК вылучаюць з клетачных культур або з мікраарганізмаў і пасля выкарыстоўваюць у якасці шаблону ПЦР. Пасля ачысткі неабходна вызначыць канцэнтрацыю ДНК, каб мець магчымасць вызначыць аб'ём, неабходны для ўстаноўкі ПЦР. Хоць электрафарэз у агарозным гелі можа служыць для ацэнкі, гэты метад далёкі ад дакладнасці. УФ-бачная спектрафатаметрыя была прызнана залатым стандартам для колькаснага вызначэння нуклеінавых кіслот; Гэты прамы, а значыць, просты і хуткі метад вымярае паглынанне ўзору пры 260 нм, а канцэнтрацыя разлічваецца з дапамогай каэфіцыента пераўтварэння.
Аднак, калі канцэнтрацыя ДНК вельмі нізкая (< 1 мкг/мл дцДНК), або калі яна забруджаная рэчывамі, якія таксама паглынаюць у дыяпазоне 260 нм (напрыклад, РНК, бялок, солі), гэты метад дасягне сваіх абмежаванняў. У выпадку вельмі нізкіх канцэнтрацый паказанні хутка стануць занадта недакладнымі, каб імі можна было карыстацца, і забруджванні прывядуць да (часам велізарнага) завышэння рэальнага значэння. У гэтым выпадку альтэрнатывай можа стаць колькасная ацэнка з выкарыстаннем флуарэсцэнцыі. Гэты метад заснаваны на выкарыстанні флуарэсцэнтнага фарбавальніка, які спецыфічна звязваецца з дцДНК — толькі комплекс, які складаецца з нуклеінавай кіслаты і фарбавальніка, узбуджаецца святлом, і пасля гэтага ён будзе выпраменьваць святло крыху большай даўжыні хвалі. Тут інтэнсіўнасць флуарэсцэнтнага сігналу прапарцыйная колькасці ДНК, і для вызначэння канцэнтрацыі яна ацэньваецца ў адносінах да стандартнай крывой. Перавагі гэтага метаду заключаюцца ў спецыфічнасці сувязі, якая выключае знешнія ўплывы, выкліканыя забруджваннем, а таксама ў атрыманай здольнасці выяўляць вельмі нізкія канцэнтрацыі ДНК. Прыдатнасць любога з метадаў залежыць галоўным чынам ад канцэнтрацыі і чысціні ўзору; у многіх выпадках нават можа быць мэтазгодным ужываць абодва метады паралельна.
Час публікацыі: 30 лістапада 2022 г.