尽管理论上一个模板分子就足够了，但经典PCR通常会使用大量的DNA，例如，最多1 µg的哺乳动物基因组DNA，以及少至1 pg的质粒DNA。最佳用量很大程度上取决于目标序列的拷贝数及其复杂性。
如果模板用量过少，则需要相应增加扩增循环数才能获得足够量的产物。大多数 PCR 实验中使用的 Taq 聚合酶不具备校正功能（3′-5′ 外切酶活性），因此无法纠正扩增过程中出现的错误。循环数越高，缺陷产物的扩增概率就越大。另一方面，如果模板用量过高，引物与其他（非 100% 互补的）序列退火以及形成引物二聚体的概率就会增加，从而导致副产物的扩增。在许多情况下，DNA 是从细胞培养物或微生物中分离出来的，随后用作 PCR 模板。纯化后，需要确定 DNA 的浓度，以便确定 PCR 反应所需的体积。虽然琼脂糖凝胶电泳可以提供估算值，但这种方法远非准确。紫外可见分光光度法已被确立为核酸定量的黄金标准；这种直接、简单、快捷的方法可以测量样品在 260 nm 处的吸光度，并借助转换因子计算浓度。
然而，如果DNA浓度非常低（< 1 µg/mL dsDNA），或者被在260 nm范围内吸收的物质（例如RNA、蛋白质、盐）污染，该方法将面临局限性。在浓度极低的情况下，读数很快就会变得非常不准确而无法使用，而污染会导致实际值被过高估计（有时甚至会过高）。在这种情况下，使用荧光定量可能是一种替代方案。该技术基于一种与dsDNA特异性结合的荧光染料，只有由核酸和染料组成的复合物才会被光激发，随后会发出波长略高的光。荧光信号的强度与DNA的量成正比，在确定浓度时，需要根据标准曲线进行评估。该方法的优势在于其结合特异性，可以排除污染带来的外部影响，并且能够检测极低浓度的DNA。两种方法的适用性主要取决于样品浓度和纯度；在许多情况下，甚至建议同时应用这两种方法。
发布时间：2022年11月30日