כאָטש אין טעאָריע וואָלט איין מאָלעקול פֿון דעם טעמפּלאַט געווען גענוג, ווערן טיפּיש גענוצט באַדייטנד גרעסערע מאָסן פֿון דנ״א פֿאַר אַ קלאַסישן פּ.ק.ר., למשל, ביז 1 מיקראָגראַם פֿון גענאָמישן זויגער־דנ״א און אַזוי ווייניק ווי 1 פּי־גראַם פֿון פּלאַזמיד־דנ״א. די אָפּטימאַלע מאָסן הענגט שטאַרק אָפּ פֿון דער צאָל קאָפּיעס פֿון דער ציל־סיקוואַנס, ווי אויך פֿון איר קאָמפּלעקסיטעט.
אויב זייער ווייניג טעמפּלאַט ווערט גענוצט, וועט מען דאַרפֿן אַ קאָרעספּאָנדירנדיקע פאַרגרעסערונג אין דער צאָל אַמפּליפיקאַציע ציקלען צו באַקומען אַ גענוגנדיקע מאָס פּראָדוקט. אַ טאַק פּאָלימעראַזע וואָס מען נוצט פֿאַר רובֿ PCR עקספּערימענטן האָט נישט קיין קאָרעקציע פֿונקציע (3′-5′ עקסאָנוקלעאַזע אַקטיוויטעט); אַזוי קענען מען נישט קאָריגירן פֿעלער וואָס פּאַסירן בעת אַמפּליפיקאַציע. ווי העכער די צאָל ציקלען, אַלץ מער פֿאַרשפּרייט וועט זיין די אַמפּליפיקאַציע פֿון פֿעלעריקן פּראָדוקט. אויב, פֿון דער אַנדערער זייט, די מאָס טעמפּלאַט איז צו הויך, וועט די וואַרשיינלעכקייט פֿון פּריימערס וואָס פֿאַרבינדן זיך מיט אַנדערע (נישט הונדערט פּראָצענט קאָמפּלעמענטאַרע) סיקוואַנסן, ווי אויך די פֿאָרמאַציע פֿון פּריימער דימערס, פֿאַרגרעסערן, וואָס וועט רעזולטירן אין דער אַמפּליפיקאַציע פֿון בייפּראָדוקטן. אין פֿיל פֿאַלן ווערט DNA אפגעזונדערט פֿון צעל קולטורן אָדער פֿון מיקראָאָרגאַניזמען און דערנאָך גענוצט ווי אַ PCR טעמפּלאַט. נאָך רייניקונג איז נויטיק צו באַשטימען די קאָנצענטראַציע פֿון דער DNA צו קענען דעפֿינירן דעם באַנד וואָס איז נויטיק פֿאַר דער PCR סעטאַפּ. כאָטש אַגאַראָז געל עלעקטראָפֿאָרעזיס קען דינען צו צושטעלן אַן אָפּשאַצונג, איז די מעטאָדע ווײַט פֿון פּינקטלעך. UV-Vis ספּעקטראָפֿאָטאָמעטריע איז געגרינדעט געוואָרן ווי דער גאָלדענער סטאַנדאַרט פֿאַר דער קוואַנטיפֿיקאַציע פֿון נוקלעאיק זויערן; די דירעקטע און דעריבער גרינגע און שנעלע מעטאָדע מעסט די אַבסאָרבאַנס פון דער מוסטער ביי 260 נם, און קאָנצענטראַציע ווערט קאַלקיאַלייטיד מיט דער הילף פון אַ קאָנווערזשאַן פאַקטאָר.
אויב די DNA קאנצענטראציע איז אבער זייער נידעריג (< 1 µg/mL dsDNA), אדער אויב עס איז פארפעסטיקט מיט סובסטאנצן וואס אויך אבזארבירן אין די 260 נ"מ ראיאן (למשל RNA, פראטעין, זאלצן), וועט די מעטאד דערגרייכן אירע באגרענעצונגען. אין פאל פון זייער נידעריגע קאנצענטראציעס, וועלן די לייענונגען באלד ווערן צו אומגענוי צו זיין נוצלעך, און פארפעסטיקונגס וועלן פירן צו (מאנchmal א ריזיקע) איבערשאצונג פון די אמת'ע ווערט. אין דעם פאל, קען קוואנטיפיקאציע מיט פלורעסצענץ פארשטעלן אן אלטערנאטיוו. די טעכניק איז באזירט אויף די נוצן פון א פלורעסצענט פארב וואס בינדט ספעציפיש צו dsDNA, נאר דער קאמפלעקס וואס באשטייט פון נוקלעאיק זויער און פארב ווערט אויפגערעגט דורך דעם ליכט, און עס וועט דערנאך ארויסלאזן ליכט פון א עטוואס העכערע כוואליע. דא, איז די אינטענסיטעט פון דעם פלורעסצענט סיגנאל פראפארציאנעל צו דער מאס DNA, און פארן באשטימען די קאנצענטראציע ווערט עס אפגעשאצט אין באצוג צו א סטאנדארט קורווע. די מעלות פון דעם מעטאד בלייבן אויף דער ספעציפישקייט פון דער בונד, וואס שליסט אויס די עקסטערנע איינפלוסן וואס ווערן אריינגעפירט דורך פארפעסטיקונגס, ווי אויך אויף דער רעזולטירנדיקער מעגלעכקייט צו דעטעקטירן זייער נידעריגע קאנצענטראציעס פון DNA. די פאסיגקייט פון יעדן מעטאד ווענדט זיך מערסטנס אויף מוסטער קאנצענטראציע און ריינקייט; אין פילע פעלער קען עס אפילו זיין ראטזאם צו אנווענדן ביידע מעטאָדן אין פּאַראַלעל.
פּאָסט צייט: 30סטן נאוועמבער 2022