Хоча теоретично однієї молекули матриці було б достатньо, для класичної ПЛР зазвичай використовуються значно більші кількості ДНК, наприклад, до 1 мкг геномної ДНК ссавців та всього 1 пг плазмідної ДНК. Оптимальна кількість значною мірою залежить від кількості копій цільової послідовності, а також від її складності.
Якщо використовується дуже мало шаблону, для отримання достатньої кількості продукту знадобиться відповідне збільшення кількості циклів ампліфікації. Taq-полімераза, яка використовується для більшості ПЛР-експериментів, не має коригувальної функції (3′-5′ екзонуклеазна активність); таким чином, помилки, що виникають під час ампліфікації, неможливо виправити. Чим більша кількість циклів, тим частіше відбувається ампліфікація дефектного продукту. З іншого боку, якщо кількість шаблону занадто висока, ймовірність відпалу праймерів до інших (не на сто відсотків комплементарних) послідовностей, а також утворення димерів праймерів, зростатиме, що призведе до ампліфікації побічних продуктів. У багатьох випадках ДНК виділяють з клітинних культур або з мікроорганізмів, а потім використовують як шаблон ПЛР. Після очищення необхідно визначити концентрацію ДНК, щоб мати змогу визначити об'єм, необхідний для проведення ПЛР. Хоча електрофорез в агарозному гелі може служити для оцінки, цей метод далеко не точний. УФ-Vis спектрофотометрія була встановлена як золотий стандарт для кількісного визначення нуклеїнових кислот; Цей прямий, а отже, простий і швидкий метод вимірює поглинання зразка при 260 нм, а концентрація розраховується за допомогою коефіцієнта перетворення.
Однак, якщо концентрація ДНК дуже низька (< 1 мкг/мл дцДНК), або якщо вона забруднена речовинами, які також поглинають у діапазоні 260 нм (наприклад, РНК, білок, солі), цей метод досягне своїх обмежень. У випадку дуже низьких концентрацій показники швидко стануть занадто неточними, щоб бути корисними, а забруднення призведуть до (іноді величезного) завищення фактичного значення. У цьому випадку кількісне визначення за допомогою флуоресценції може стати альтернативою. Цей метод базується на використанні флуоресцентного барвника, який специфічно зв'язується з дцДНК - світло збуджує лише комплекс, що складається з нуклеїнової кислоти та барвника, і він згодом випромінює світло трохи вищої довжини хвилі. Тут інтенсивність флуоресцентного сигналу пропорційна кількості ДНК, і для визначення концентрації вона оцінюється відносно стандартної кривої. Переваги цього методу полягають у специфічності зв'язку, що виключає зовнішні впливи, спричинені забрудненням, а також у результуючій здатності виявляти дуже низькі концентрації ДНК. Придатність будь-якого з методів залежить головним чином від концентрації та чистоти зразка; у багатьох випадках навіть доцільно застосовувати обидва методи паралельно.
Час публікації: 30 листопада 2022 р.