Teoride, şablonun bir molekülü yeterli olsa da, klasik bir PCR için tipik olarak önemli miktarda DNA kullanılır, örneğin, 1 µg'a kadar genomik memeli DNA'sı ve 1 pg kadar az plazmit DNA'sı. Optimum miktar büyük ölçüde hedef dizinin kopya sayısına ve karmaşıklığına bağlıdır.
Çok az şablon kullanılırsa, yeterli miktarda ürün elde etmek için amplifikasyon döngülerinin sayısında buna karşılık gelen bir artış gerekecektir. Çoğu PCR deneyi için kullanılan bir Taq polimerazı bir düzeltme fonksiyonuna (3′-5′ ekzonükleaz aktivitesi) sahip değildir; bu nedenle, amplifikasyon sırasında oluşan hatalar düzeltilemez. Döngü sayısı ne kadar yüksekse, hatalı ürünün amplifikasyonu o kadar yaygın olacaktır. Öte yandan, şablon miktarı çok yüksekse, primerlerin diğer (yüzde yüz tamamlayıcı olmayan) dizilere bağlanma olasılığı ve primer dimerlerinin oluşumu artacak ve bu da yan ürünlerin amplifikasyonuyla sonuçlanacaktır. Birçok durumda, DNA hücre kültürlerinden veya mikroorganizmalardan izole edilir ve daha sonra bir PCR şablonu olarak kullanılır. Saflaştırmanın ardından, PCR kurulumu için gereken hacmi tanımlayabilmek için DNA konsantrasyonunun belirlenmesi gerekir. Agar jel elektroforezi bir tahmin sağlamaya hizmet edebilirken, bu yöntem doğru olmaktan uzaktır. UV-Vis spektrofotometrisi, nükleik asitlerin kantifikasyonunda altın standart olarak kabul edilmiştir; bu doğrudan, dolayısıyla kolay ve hızlı yöntem, numunenin 260 nm'deki absorbansını ölçer ve konsantrasyon, bir dönüşüm faktörü yardımıyla hesaplanır.
Ancak DNA konsantrasyonu çok düşükse (< 1 µg/mL dsDNA) veya 260 nm aralığında emilim yapan maddelerle (örneğin RNA, protein, tuzlar) kirlenmişse, bu yöntem sınırlarına ulaşacaktır. Çok düşük konsantrasyonlarda, okumalar kısa sürede kullanışlı olamayacak kadar yanlış hale gelecek ve kirlenmeler gerçek değerin (bazen çok büyük) fazla tahmin edilmesine yol açacaktır. Bu durumda, floresan kullanılarak kantifikasyon bir alternatif sunabilir. Bu teknik, yalnızca nükleik asit ve boyadan oluşan kompleks ışık tarafından uyarıldığında dsDNA'ya özgül olarak bağlanan bir floresan boyanın kullanımına dayanmaktadır ve daha sonra biraz daha yüksek dalga boyunda ışık yayacaktır. Burada, floresan sinyalin yoğunluğu DNA miktarıyla orantılıdır ve konsantrasyonu belirlemek için standart bir eğriye göre değerlendirilir. Bu yöntemin avantajları, kontaminasyondan kaynaklanan dış etkileri dışlayan bağın özgüllüğüne ve çok düşük DNA konsantrasyonlarını tespit etme yeteneğine dayanır. Her iki yöntemin uygunluğu esas olarak numune konsantrasyonuna ve saflığına bağlıdır; birçok durumda her iki yöntemin paralel olarak uygulanması bile tavsiye edilebilir.
Yayınlanma zamanı: 30-Kas-2022