แม้ว่าในทางทฤษฎี โมเลกุลเดียวของเทมเพลตจะเพียงพอ แต่โดยทั่วไปแล้ว ปริมาณดีเอ็นเอที่มากขึ้นอย่างมากจะถูกใช้สำหรับ PCR แบบคลาสสิก เช่น ดีเอ็นเอของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมในจีโนมสูงสุด 1 ไมโครกรัม และดีเอ็นเอพลาสมิดน้อยถึง 1 พิกกรัม ปริมาณที่เหมาะสมที่สุดนั้นขึ้นอยู่กับจำนวนสำเนาของลำดับเป้าหมายเป็นส่วนใหญ่ รวมถึงความซับซ้อนของลำดับเป้าหมายด้วย
หากใช้เทมเพลตเพียงเล็กน้อย จะต้องเพิ่มจำนวนรอบการขยายตามไปด้วยเพื่อให้ได้ผลิตภัณฑ์ในปริมาณที่เพียงพอ โพลีเมอเรส Taq ที่ใช้สำหรับการทดลอง PCR ส่วนใหญ่ไม่มีฟังก์ชันการแก้ไข (กิจกรรมเอ็กโซนิวคลีเอส 3′-5′) ดังนั้น จึงไม่สามารถแก้ไขข้อผิดพลาดที่เกิดขึ้นระหว่างการขยายได้ ยิ่งจำนวนรอบมากขึ้น การขยายผลิตภัณฑ์ที่มีข้อบกพร่องก็จะยิ่งแพร่หลายมากขึ้น ในทางกลับกัน หากปริมาณเทมเพลตสูงเกินไป โอกาสที่ไพรเมอร์จะแอนนีลกับลำดับอื่นๆ (ที่ไม่เสริมกันร้อยเปอร์เซ็นต์) รวมถึงการก่อตัวของไดเมอร์ของไพรเมอร์ก็จะเพิ่มขึ้น ซึ่งจะส่งผลให้ผลิตภัณฑ์รองขยายตัว ในหลายกรณี DNA จะถูกแยกออกจากการเพาะเลี้ยงเซลล์หรือจากจุลินทรีย์ จากนั้นจึงใช้เป็นเทมเพลต PCR ในภายหลัง หลังจากการทำให้บริสุทธิ์ จำเป็นต้องกำหนดความเข้มข้นของ DNA เพื่อให้สามารถกำหนดปริมาตรที่จำเป็นสำหรับการตั้งค่า PCR ได้ แม้ว่าอิเล็กโทรโฟรีซิสเจลอะกาโรสอาจช่วยให้ประมาณการได้ แต่วิธีนี้ยังห่างไกลจากความแม่นยำ สเปกโตรโฟโตเมตรี UV-Vis ได้รับการยอมรับให้เป็นมาตรฐานทองคำสำหรับการตรวจวัดปริมาณกรดนิวคลีอิก วิธีการนี้โดยตรง จึงง่ายและรวดเร็ว สามารถวัดค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่างที่ 260 นาโนเมตร และคำนวณความเข้มข้นด้วยความช่วยเหลือของปัจจัยการแปลง
อย่างไรก็ตาม หากความเข้มข้นของ DNA ต่ำมาก (< 1 µg/mL dsDNA) หรือปนเปื้อนด้วยสารที่ดูดซับในช่วง 260 นาโนเมตร (เช่น RNA โปรตีน เกลือ) วิธีนี้จะถึงขีดจำกัด ในกรณีที่ความเข้มข้นต่ำมาก การอ่านค่าจะแม่นยำเกินไปจนไม่สามารถนำไปใช้ได้ และการปนเปื้อนจะนำไปสู่การประเมินค่าจริงเกินจริง (บางครั้งอาจมากเกินไป) ในกรณีนี้ การวัดปริมาณโดยใช้การเรืองแสงอาจเป็นทางเลือกอื่น เทคนิคนี้ใช้สีย้อมเรืองแสงที่จับกับ dsDNA โดยเฉพาะ โดยแสงจะกระตุ้นเฉพาะสารเชิงซ้อนที่ประกอบด้วยกรดนิวคลีอิกและสีย้อมเท่านั้น จากนั้นจะปล่อยแสงที่มีความยาวคลื่นสูงกว่าเล็กน้อย ในที่นี้ ความเข้มของสัญญาณเรืองแสงจะแปรผันตามปริมาณของ DNA และเพื่อกำหนดความเข้มข้น จะทำการประเมินโดยอ้างอิงกับเส้นโค้งมาตรฐาน ข้อดีของวิธีนี้ขึ้นอยู่กับความจำเพาะของพันธะซึ่งตัดอิทธิพลภายนอกที่เกิดจากการปนเปื้อนออกไป รวมถึงความสามารถในการตรวจจับ DNA ที่มีความเข้มข้นต่ำมาก ความเหมาะสมของวิธีใดวิธีหนึ่งขึ้นอยู่กับความเข้มข้นและความบริสุทธิ์ของตัวอย่างเป็นหลัก ในหลายๆ กรณี อาจแนะนำให้ใช้ทั้งสองวิธีควบคู่กัน
เวลาโพสต์: 30 พ.ย. 2565