నా PCR రియాక్షన్‌కు ఎంత టెంప్లేట్ జోడించాలి?

సిద్ధాంతపరంగా, టెంప్లేట్ యొక్క ఒక అణువు సరిపోతుంది, అయితే క్లాసిక్ PCR కోసం చాలా ఎక్కువ మొత్తంలో DNA ఉపయోగించబడుతుంది, ఉదాహరణకు, 1 µg వరకు జన్యు క్షీరద DNA మరియు 1 pg కంటే తక్కువ ప్లాస్మిడ్ DNA. సరైన మొత్తం ఎక్కువగా లక్ష్య శ్రేణి యొక్క కాపీల సంఖ్యపై, అలాగే దాని సంక్లిష్టతపై ఆధారపడి ఉంటుంది.

చాలా తక్కువ టెంప్లేట్‌ను ఉపయోగించినట్లయితే, తగినంత మొత్తంలో ఉత్పత్తిని పొందడానికి యాంప్లిఫికేషన్ సైకిల్స్ సంఖ్యలో తదనుగుణంగా పెరుగుదల అవసరం అవుతుంది. చాలా PCR ప్రయోగాలకు ఉపయోగించే టాక్ పాలిమరేస్‌లో కరెక్షన్ ఫంక్షన్ (3′-5′ ఎక్సోన్యూక్లీస్ యాక్టివిటీ) ఉండదు; అందువల్ల, యాంప్లిఫికేషన్ సమయంలో సంభవించే లోపాలను సరిదిద్దలేము. సైకిల్‌ల సంఖ్య ఎక్కువగా ఉంటే, లోపభూయిష్ట ఉత్పత్తి యొక్క యాంప్లిఫికేషన్ ఎక్కువగా ఉంటుంది. మరోవైపు, టెంప్లేట్ మొత్తం చాలా ఎక్కువగా ఉంటే, ప్రైమర్‌లు ఇతర (వంద శాతం కాంప్లిమెంటరీ కాదు) సీక్వెన్స్‌లకు ఎనియల్ అయ్యే సంభావ్యత, అలాగే ప్రైమర్ డైమర్‌లు ఏర్పడటం పెరుగుతుంది, దీని ఫలితంగా ఉప-ఉత్పత్తుల యాంప్లిఫికేషన్ జరుగుతుంది. చాలా సందర్భాలలో, DNA సెల్ కల్చర్‌ల నుండి లేదా సూక్ష్మజీవుల నుండి వేరుచేయబడుతుంది మరియు తరువాత PCR టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించబడుతుంది. శుద్దీకరణ తర్వాత, PCR సెటప్‌కు అవసరమైన వాల్యూమ్‌ను నిర్వచించగలిగేలా DNA యొక్క గాఢతను నిర్ణయించడం అవసరం. అగరోజ్ జెల్ ఎలక్ట్రోఫోరేసిస్ అంచనాను అందించడానికి ఉపయోగపడవచ్చు, ఈ పద్ధతి ఖచ్చితమైనది కాదు. న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాల పరిమాణీకరణకు UV-Vis స్పెక్ట్రోఫోటోమెట్రీ బంగారు ప్రమాణంగా స్థాపించబడింది; ఈ ప్రత్యక్ష మరియు అందువల్ల సులభమైన మరియు శీఘ్ర పద్ధతి 260 nm వద్ద నమూనా యొక్క శోషణను కొలుస్తుంది మరియు ఏకాగ్రతను మార్పిడి కారకం సహాయంతో లెక్కిస్తారు.

DNA సాంద్రత చాలా తక్కువగా ఉంటే, అయితే (< 1 µg/mL dsDNA), లేదా 260 nm పరిధిలో (ఉదా. RNA, ప్రోటీన్, లవణాలు) కూడా గ్రహించే పదార్థాలతో కలుషితమైతే, ఈ పద్ధతి దాని పరిమితులను చేరుకుంటుంది. చాలా తక్కువ సాంద్రతల విషయంలో, రీడింగ్‌లు త్వరలో ఉపయోగించడానికి చాలా సరికాదు మరియు కాలుష్యాలు వాస్తవ విలువను (కొన్నిసార్లు అపారమైనవి) అతిగా అంచనా వేయడానికి దారితీస్తాయి. ఈ సందర్భంలో, ఫ్లోరోసెన్స్‌ని ఉపయోగించి పరిమాణీకరణ ఒక ప్రత్యామ్నాయాన్ని అందించవచ్చు. ఈ సాంకేతికత ఫ్లోరోసెంట్ డై వాడకంపై ఆధారపడి ఉంటుంది, ఇది ప్రత్యేకంగా dsDNAకి బంధిస్తుంది, న్యూక్లియిక్ ఆమ్లం మరియు రంగుతో కూడిన కాంప్లెక్స్ మాత్రమే కాంతి ద్వారా ఉత్తేజితమవుతుంది మరియు ఇది తరువాత కొంచెం ఎక్కువ తరంగదైర్ఘ్యం యొక్క కాంతిని విడుదల చేస్తుంది. ఇక్కడ, ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్ యొక్క తీవ్రత DNA మొత్తానికి అనులోమానుపాతంలో ఉంటుంది మరియు ఏకాగ్రతను నిర్ణయించడానికి ఇది ప్రామాణిక వక్రతకు సంబంధించి మూల్యాంకనం చేయబడుతుంది. ఈ పద్ధతి యొక్క ప్రయోజనాలు బంధం యొక్క విశిష్టతపై ఆధారపడి ఉంటాయి, ఇది కాలుష్యం ద్వారా ప్రవేశపెట్టబడిన బాహ్య ప్రభావాలను మినహాయించి, అలాగే DNA యొక్క చాలా తక్కువ సాంద్రతలను గుర్తించే ఫలిత సామర్థ్యంపై ఆధారపడి ఉంటుంది. రెండు పద్ధతుల అనుకూలత ప్రధానంగా నమూనా ఏకాగ్రత మరియు స్వచ్ఛతపై ఆధారపడి ఉంటుంది; చాలా సందర్భాలలో రెండు పద్ధతులను సమాంతరంగా వర్తింపజేయడం కూడా మంచిది కావచ్చు.