මගේ PCR ප්‍රතික්‍රියාවට කොපමණ සැකිලි ප්‍රමාණයක් එකතු කළ යුතුද?

න්‍යායාත්මකව, සැකිල්ලේ එක් අණුවක් ප්‍රමාණවත් වුවද, සම්භාව්‍ය PCR සඳහා සාමාන්‍යයෙන් සැලකිය යුතු ලෙස විශාල DNA ප්‍රමාණයක් භාවිතා වේ, උදාහරණයක් ලෙස, ජෙනෝමික් ක්ෂීරපායී DNA 1 µg දක්වා සහ ප්ලාස්මිඩ් DNA 1 pg තරම් කුඩා ප්‍රමාණයක්. ප්‍රශස්ත ප්‍රමාණය බොහෝ දුරට ඉලක්ක අනුපිළිවෙලෙහි පිටපත් ගණන මෙන්ම එහි සංකීර්ණත්වය මත රඳා පවතී.

ඉතා සුළු සැකිල්ලක් භාවිතා කරන්නේ නම්, ප්‍රමාණවත් නිෂ්පාදන ප්‍රමාණයක් ලබා ගැනීම සඳහා විස්තාරණ චක්‍ර ගණනෙහි අනුරූප වැඩි වීමක් අවශ්‍ය වේ. බොහෝ PCR අත්හදා බැලීම් සඳහා භාවිතා කරන Taq පොලිමරේස් එකක නිවැරදි කිරීමේ ශ්‍රිතයක් නොමැත (3′-5′ exonuclease ක්‍රියාකාරකම්); එබැවින්, විස්තාරණය අතරතුර සිදුවන දෝෂ නිවැරදි කළ නොහැක. චක්‍ර ගණන වැඩි වන තරමට, දෝෂ සහිත නිෂ්පාදනයේ විස්තාරණය වඩාත් ප්‍රචලිත වනු ඇත. අනෙක් අතට, සැකිල්ලේ ප්‍රමාණය ඉතා ඉහළ නම්, ප්‍රයිමර් අනෙකුත් (සියයට සියයක් නොවන අනුපූරක) අනුපිළිවෙලට ඇනීල් කිරීමේ සම්භාවිතාව මෙන්ම ප්‍රයිමර් ඩයිමර් සෑදීමද වැඩි වනු ඇත, එමඟින් අතුරු නිෂ්පාදන විස්තාරණය වේ. බොහෝ අවස්ථාවන්හිදී, DNA සෛල සංස්කෘතීන්ගෙන් හෝ ක්ෂුද්‍ර ජීවීන්ගෙන් හුදකලා කර පසුව PCR සැකිල්ලක් ලෙස භාවිතා කරයි. පිරිසිදු කිරීමෙන් පසු, PCR සැකසුම සඳහා අවශ්‍ය පරිමාව නිර්වචනය කිරීමට හැකි වන පරිදි DNA සාන්ද්‍රණය තීරණය කිරීම අවශ්‍ය වේ. ඇගරෝස් ජෙල් විද්‍යුත් විච්ඡේදනය ඇස්තමේන්තුවක් සැපයීමට සේවය කළ හැකි වුවද, මෙම ක්‍රමය නිවැරදි නොවේ. න්‍යෂ්ටික අම්ල ප්‍රමාණනය සඳහා රන් ප්‍රමිතිය ලෙස UV-Vis වර්ණාවලීක්ෂමිතිය ස්ථාපිත කර ඇත; මෙම සෘජු හා එබැවින් පහසු සහ ඉක්මන් ක්‍රමය 260 nm දී සාම්පලයේ අවශෝෂණය මනිනු ලබන අතර, සාන්ද්‍රණය ගණනය කරනු ලබන්නේ පරිවර්තන සාධකයක් භාවිතා කරමිනි.

කෙසේ වෙතත්, DNA සාන්ද්‍රණය ඉතා අඩු නම්, (< 1 µg/mL dsDNA), හෝ 260 nm පරාසය තුළ අවශෝෂණය කරන ද්‍රව්‍ය (උදා: RNA, ප්‍රෝටීන්, ලවණ) වලින් එය දූෂිත වී ඇත්නම්, මෙම ක්‍රමය එහි සීමාවන් කරා ළඟා වනු ඇත. ඉතා අඩු සාන්ද්‍රණයකදී, කියවීම් ඉක්මනින් භාවිතයට ගත නොහැකි තරම් සාවද්‍ය වන අතර, දූෂණයන් සත්‍ය අගය (සමහර විට දැවැන්ත) අධි තක්සේරුවකට තුඩු දෙනු ඇත. මෙම අවස්ථාවේ දී, ප්‍රතිදීප්තතාව භාවිතා කරන ප්‍රමාණනය විකල්පයක් ඉදිරිපත් කළ හැකිය. මෙම තාක්ෂණය පදනම් වී ඇත්තේ dsDNA වෙත විශේෂයෙන් බන්ධනය වන ප්‍රතිදීප්ත ඩයි වර්ගයක් භාවිතා කිරීම මත වන අතර එය න්‍යෂ්ටික අම්ලය සහ ඩයි වලින් සමන්විත සංකීර්ණය පමණක් ආලෝකයෙන් උද්දීපනය වන අතර එය පසුව තරමක් ඉහළ තරංග ආයාමයකින් යුත් ආලෝකයක් විමෝචනය කරයි. මෙහිදී, ප්‍රතිදීප්ත සංඥාවේ තීව්‍රතාවය DNA ප්‍රමාණයට සමානුපාතික වන අතර, සාන්ද්‍රණය තීරණය කිරීම සඳහා එය සම්මත වක්‍රයකට සාපේක්ෂව ඇගයීමට ලක් කෙරේ. මෙම ක්‍රමයේ වාසි රඳා පවතින්නේ දූෂණය මගින් හඳුන්වා දෙන බාහිර බලපෑම් බැහැර කරන බන්ධනයේ නිශ්චිතභාවය මෙන්ම ඉතා අඩු DNA සාන්ද්‍රණයන් හඳුනා ගැනීමේ ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ඇති හැකියාව මත ය. එක් එක් ක්‍රමයේ යෝග්‍යතාවය ප්‍රධාන වශයෙන් නියැදි සාන්ද්‍රණය සහ සංශුද්ධතාවය මත රඳා පවතී; බොහෝ අවස්ථාවලදී ක්‍රම දෙකම සමාන්තරව යෙදීම පවා සුදුසු විය හැකිය.