اسان کي پنهنجي پي سي آر رد عمل ۾ ڪيترو ٽيمپليٽ شامل ڪرڻ گهرجي؟

جيتوڻيڪ نظريي ۾، ٽيمپليٽ جو هڪ ماليڪيول ڪافي هوندو، عام طور تي ڪلاسيڪل پي سي آر لاءِ ڊي اين اي جي تمام گهڻي مقدار استعمال ڪئي ويندي آهي، مثال طور، جينومڪ ممالين ڊي اين اي جي 1 µg تائين ۽ پلازمڊ ڊي اين اي جي 1 پي جي جيترو گهٽ. بهترين مقدار وڏي حد تائين ٽارگيٽ تسلسل جي ڪاپين جي تعداد تي، انهي سان گڏ ان جي پيچيدگي تي منحصر آهي.

جيڪڏهن تمام گهٽ ٽيمپليٽ استعمال ڪيو وڃي، ته ڪافي مقدار ۾ پراڊڪٽ حاصل ڪرڻ لاءِ ايمپليفڪيشن سائيڪلن جي تعداد ۾ ساڳئي واڌ جي ضرورت پوندي. هڪ ٽاڪ پوليمريز جيڪو اڪثر پي سي آر تجربن لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي ان ۾ اصلاحي فنڪشن (3′-5′ ايڪسونڪليئيز سرگرمي) شامل ناهي؛ تنهن ڪري، ايمپليفڪيشن دوران ٿيندڙ غلطيون درست نه ٿي سگهن. سائيڪلن جو تعداد جيترو وڌيڪ هوندو، اوترو ئي خراب پراڊڪٽ جي ايمپليفڪيشن وڌيڪ عام هوندي. جيڪڏهن، ٻئي طرف، ٽيمپليٽ جي مقدار تمام گهڻي هوندي، ته پرائمرز جي ٻين (هڪ سئو سيڪڙو مڪمل نه) تسلسلن سان اينيل ٿيڻ جو امڪان، انهي سان گڏ پرائمر ڊائمرز جي ٺهڻ جو امڪان وڌي ويندو، جنهن جي نتيجي ۾ ضمني شين جي ايمپليفڪيشن ٿيندي. ڪيترن ئي ڪيسن ۾، ڊي اين اي کي سيل ڪلچر يا مائڪروجنزمن کان الڳ ڪيو ويندو آهي ۽ بعد ۾ پي سي آر ٽيمپليٽ طور استعمال ڪيو ويندو آهي. صاف ڪرڻ کان پوءِ، پي سي آر سيٽ اپ لاءِ گهربل حجم کي بيان ڪرڻ جي قابل ٿيڻ لاءِ ڊي اين اي جي ڪنسنٽريشن کي طئي ڪرڻ ضروري آهي. جڏهن ته اگروز جيل اليڪٽروفوريسس اندازو لڳائڻ لاءِ ڪم ڪري سگهي ٿو، هي طريقو صحيح کان پري آهي. يو وي-وِس اسپيڪٽروفوٽوميٽري کي نيوڪلڪ ايسڊ جي مقدار جي لاءِ سون جي معيار طور قائم ڪيو ويو آهي؛ هي سڌو ۽ تنهن ڪري آسان ۽ تڪڙو طريقو 260 اين ايم تي نموني جي جذب کي ماپي ٿو، ۽ ڪنسنٽريشن کي ڪنورشن فيڪٽر جي مدد سان ڳڻيو ويندو آهي.

جيڪڏهن ڊي اين اي ڪنسنٽريشن تمام گهٽ آهي، تڏهن به (<1 µg/mL dsDNA)، يا جيڪڏهن اهو انهن شين سان آلوده آهي جيڪي 260 nm رينج ۾ پڻ جذب ڪن ٿا (مثال طور RNA، پروٽين، لوڻ)، ته هي طريقو پنهنجي حد تائين پهچي ويندو. تمام گهٽ ڪنسنٽريشن جي صورت ۾، ريڊنگ جلد ئي استعمال جي قابل نه هجڻ لاءِ تمام گهڻي غلط ٿي ويندي، ۽ آلودگي اصل قدر جي (ڪڏهن ڪڏهن تمام گهڻي) حد کان وڌيڪ اندازي جو سبب بڻجندي. هن صورت ۾، فلوروسينس استعمال ڪندي مقدار جي تصديق هڪ متبادل پيش ڪري سگهي ٿي. هي ٽيڪنڪ هڪ فلوروسينٽ رنگ جي استعمال تي ٻڌل آهي جيڪا خاص طور تي dsDNA سان ڳنڍيل آهي صرف نيوڪليڪ ايسڊ ۽ رنگ تي مشتمل پيچيده روشني سان پرجوش آهي، ۽ اهو بعد ۾ ٿوري وڌيڪ طول موج جي روشني خارج ڪندو. هتي، فلوروسينٽ سگنل جي شدت ڊي اين اي جي مقدار جي متناسب آهي، ۽ ڪنسنٽريشن کي طئي ڪرڻ لاءِ ان جو جائزو هڪ معياري وکر جي حوالي سان ڪيو ويندو آهي. هن طريقي جا فائدا بانڊ جي خاصيت تي ٻڌل آهن، جيڪو آلودگي پاران متعارف ڪرايل ٻاهرين اثرن کي خارج ڪري ٿو، انهي سان گڏ ڊي اين اي جي تمام گهٽ ڪنسنٽريشن کي ڳولڻ جي نتيجي ۾ صلاحيت تي. ڪنهن به طريقي جي موزونيت بنيادي طور تي نموني جي ڪنسنٽريشن ۽ پاڪائي تي منحصر آهي؛ ڪيترن ئي ڪيسن ۾ اهو به صلاح ڏني وڃي ٿي ته ٻنهي طريقن کي متوازي طور تي لاڳو ڪيو وڃي.