Chiar dacă, în teorie, o moleculă din șablon ar fi suficientă, pentru o PCR clasică se utilizează de obicei cantități considerabil mai mari de ADN, de exemplu, până la 1 µg de ADN genomic de mamifere și doar 1 pg de ADN plasmidic. Cantitatea optimă depinde în mare măsură de numărul de copii ale secvenței țintă, precum și de complexitatea acesteia.
Dacă se utilizează o cantitate foarte mică de șablon, va fi necesară o creștere corespunzătoare a numărului de cicluri de amplificare pentru a obține o cantitate suficientă de produs. O polimerază Taq utilizată pentru majoritatea experimentelor PCR nu prezintă o funcție de corecție (activitate exonucleazică 3′-5′); prin urmare, erorile care apar în timpul amplificării nu pot fi corectate. Cu cât numărul de cicluri este mai mare, cu atât amplificarea produsului defect va fi mai răspândită. Pe de altă parte, dacă cantitatea de șablon este prea mare, probabilitatea ca primerii să se conecteze la alte secvențe (nu sută la sută complementare), precum și formarea de dimeri de primeri, vor crește, ceea ce va duce la amplificarea produselor secundare. În multe cazuri, ADN-ul este izolat din culturi celulare sau din microorganisme și ulterior utilizat ca șablon PCR. După purificare, este necesar să se determine concentrația ADN-ului pentru a putea defini volumul necesar pentru configurația PCR. Deși electroforeza pe gel de agaroză poate servi la furnizarea unei estimări, această metodă este departe de a fi precisă. Spectrofotometria UV-Vis a fost stabilită ca standard de aur pentru cuantificarea acizilor nucleici; Această metodă directă și, prin urmare, ușoară și rapidă, măsoară absorbanța probei la 260 nm, iar concentrația este calculată cu ajutorul unui factor de conversie.
Dacă însă concentrația de ADN este foarte scăzută (< 1 µg/mL ADN bicatenar) sau dacă este contaminat cu substanțe care absorb și ele în intervalul de 260 nm (de exemplu, ARN, proteine, săruri), această metodă își va atinge limitele. În cazul unor concentrații foarte scăzute, valorile vor deveni în curând prea inexacte pentru a fi utile, iar contaminările vor duce la o supraestimare (uneori enormă) a valorii reale. În acest caz, cuantificarea folosind fluorescența poate reprezenta o alternativă. Această tehnică se bazează pe utilizarea unui colorant fluorescent care se leagă specific de ADN bicatenar; doar complexul format din acid nucleic și colorant este excitat de lumină și, ulterior, va emite lumină cu o lungime de undă puțin mai mare. Aici, intensitatea semnalului fluorescent este proporțională cu cantitatea de ADN, iar pentru determinarea concentrației este evaluată în raport cu o curbă standard. Avantajele acestei metode constă în specificitatea legăturii, care exclude influențele externe introduse de contaminare, precum și în capacitatea rezultată de a detecta concentrații foarte scăzute de ADN. Adecvarea oricăreia dintre metode depinde în principal de concentrația și puritatea probei; în multe cazuri poate fi chiar recomandabil să se aplice ambele metode în paralel.
Data publicării: 30 noiembrie 2022