ਭਾਵੇਂ ਸਿਧਾਂਤ ਵਿੱਚ, ਟੈਂਪਲੇਟ ਦਾ ਇੱਕ ਅਣੂ ਕਾਫ਼ੀ ਹੋਵੇਗਾ, ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੱਕ ਕਲਾਸਿਕ ਪੀਸੀਆਰ ਲਈ ਕਾਫ਼ੀ ਵੱਡੀ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਡੀਐਨਏ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, 1 µg ਤੱਕ ਜੀਨੋਮਿਕ ਥਣਧਾਰੀ ਡੀਐਨਏ ਅਤੇ 1 pg ਜਿੰਨਾ ਘੱਟ ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ ਡੀਐਨਏ। ਅਨੁਕੂਲ ਮਾਤਰਾ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਕ੍ਰਮ ਦੀਆਂ ਕਾਪੀਆਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ, ਅਤੇ ਨਾਲ ਹੀ ਇਸਦੀ ਜਟਿਲਤਾ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦੀ ਹੈ।
ਜੇਕਰ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਟੈਂਪਲੇਟ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਉਤਪਾਦ ਦੀ ਕਾਫ਼ੀ ਮਾਤਰਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਚੱਕਰਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਵਿੱਚ ਅਨੁਸਾਰੀ ਵਾਧੇ ਦੀ ਲੋੜ ਹੋਵੇਗੀ। ਇੱਕ ਟਾਕ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਜੋ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਵਿੱਚ ਸੁਧਾਰ ਫੰਕਸ਼ਨ (3′-5′ ਐਕਸੋਨਿਊਕਲੀਜ਼ ਗਤੀਵਿਧੀ) ਨਹੀਂ ਹੁੰਦਾ; ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਦੌਰਾਨ ਹੋਣ ਵਾਲੀਆਂ ਗਲਤੀਆਂ ਨੂੰ ਠੀਕ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ। ਚੱਕਰਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਜਿੰਨੀ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੋਵੇਗੀ, ਨੁਕਸਦਾਰ ਉਤਪਾਦ ਦਾ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਓਨਾ ਹੀ ਜ਼ਿਆਦਾ ਪ੍ਰਚਲਿਤ ਹੋਵੇਗਾ। ਜੇਕਰ, ਦੂਜੇ ਪਾਸੇ, ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਦੂਜੇ (ਸੌ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ ਪੂਰਕ ਨਹੀਂ) ਕ੍ਰਮਾਂ ਨਾਲ ਐਨੀਲਿੰਗ ਹੋਣ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ, ਅਤੇ ਨਾਲ ਹੀ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਗਠਨ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਵਧ ਜਾਵੇਗੀ, ਜਿਸਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਉਪ-ਉਤਪਾਦਾਂ ਦਾ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਹੋਵੇਗਾ। ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ, ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਸੈੱਲ ਕਲਚਰ ਜਾਂ ਸੂਖਮ ਜੀਵਾਂ ਤੋਂ ਅਲੱਗ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਪੀਸੀਆਰ ਟੈਂਪਲੇਟ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਸ਼ੁੱਧੀਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਪੀਸੀਆਰ ਸੈੱਟਅੱਪ ਲਈ ਲੋੜੀਂਦੇ ਵਾਲੀਅਮ ਨੂੰ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਹੋਣ ਲਈ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨਾ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੈ। ਜਦੋਂ ਕਿ ਐਗਰੋਜ਼ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਇੱਕ ਅਨੁਮਾਨ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਨ ਲਈ ਕੰਮ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਇਹ ਵਿਧੀ ਸਹੀ ਤੋਂ ਬਹੁਤ ਦੂਰ ਹੈ। ਯੂਵੀ-ਵਿਜ਼ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਫੋਟੋਮੈਟਰੀ ਨੂੰ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਸੋਨੇ ਦੇ ਮਿਆਰ ਵਜੋਂ ਸਥਾਪਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ; ਇਹ ਸਿੱਧਾ ਅਤੇ ਇਸ ਲਈ ਆਸਾਨ ਅਤੇ ਤੇਜ਼ ਤਰੀਕਾ 260 nm 'ਤੇ ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਸੋਖਣ ਨੂੰ ਮਾਪਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਕਾਗਰਤਾ ਦੀ ਗਣਨਾ ਇੱਕ ਪਰਿਵਰਤਨ ਕਾਰਕ ਦੀ ਮਦਦ ਨਾਲ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।
ਜੇਕਰ ਡੀਐਨਏ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਹੈ, ਹਾਲਾਂਕਿ (< 1 µg/mL dsDNA), ਜਾਂ ਜੇਕਰ ਇਹ ਉਹਨਾਂ ਪਦਾਰਥਾਂ ਨਾਲ ਦੂਸ਼ਿਤ ਹੈ ਜੋ 260 nm ਰੇਂਜ ਵਿੱਚ ਵੀ ਸੋਖਦੇ ਹਨ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ RNA, ਪ੍ਰੋਟੀਨ, ਲੂਣ), ਤਾਂ ਇਹ ਵਿਧੀ ਆਪਣੀਆਂ ਸੀਮਾਵਾਂ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚ ਜਾਵੇਗੀ। ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੇ ਮਾਮਲੇ ਵਿੱਚ, ਰੀਡਿੰਗ ਜਲਦੀ ਹੀ ਵਰਤੋਂ ਲਈ ਬਹੁਤ ਗਲਤ ਹੋ ਜਾਵੇਗੀ, ਅਤੇ ਗੰਦਗੀ ਅਸਲ ਮੁੱਲ ਦੇ (ਕਈ ਵਾਰ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ) ਜ਼ਿਆਦਾ ਅਨੁਮਾਨ ਵੱਲ ਲੈ ਜਾਵੇਗੀ। ਇਸ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ, ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਮਾਤਰਾ ਇੱਕ ਵਿਕਲਪ ਪੇਸ਼ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਇਹ ਤਕਨੀਕ ਇੱਕ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਡਾਈ ਦੀ ਵਰਤੋਂ 'ਤੇ ਅਧਾਰਤ ਹੈ ਜੋ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ dsDNA ਨਾਲ ਜੁੜਦੀ ਹੈ ਸਿਰਫ਼ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਅਤੇ ਡਾਈ ਵਾਲੇ ਕੰਪਲੈਕਸ ਨੂੰ ਰੌਸ਼ਨੀ ਦੁਆਰਾ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਹ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਥੋੜ੍ਹੀ ਉੱਚ ਤਰੰਗ-ਲੰਬਾਈ ਦੀ ਰੌਸ਼ਨੀ ਛੱਡੇਗਾ। ਇੱਥੇ, ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਸਿਗਨਲ ਦੀ ਤੀਬਰਤਾ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਦੇ ਅਨੁਪਾਤੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਇਸਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਇੱਕ ਮਿਆਰੀ ਕਰਵ ਦੇ ਸੰਬੰਧ ਵਿੱਚ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਵਿਧੀ ਦੇ ਫਾਇਦੇ ਬਾਂਡ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਗੰਦਗੀ ਦੁਆਰਾ ਪੇਸ਼ ਕੀਤੇ ਗਏ ਬਾਹਰੀ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ ਨੂੰ ਬਾਹਰ ਕੱਢਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਨਾਲ ਹੀ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਦੀ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਯੋਗਤਾ 'ਤੇ ਵੀ। ਕਿਸੇ ਵੀ ਢੰਗ ਦੀ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਅਤੇ ਸ਼ੁੱਧਤਾ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦੀ ਹੈ; ਕਈ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ ਦੋਵਾਂ ਤਰੀਕਿਆਂ ਨੂੰ ਸਮਾਨਾਂਤਰ ਲਾਗੂ ਕਰਨਾ ਵੀ ਸਲਾਹਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਪੋਸਟ ਸਮਾਂ: ਨਵੰਬਰ-30-2022