Och wann theoretesch ee Molekül vun der Schabloun duer geet, gi fir eng klassesch PCR typescherweis däitlech méi grouss Quantitéiten un DNA benotzt, zum Beispill bis zu 1 µg genomesch Säugetier-DNA a just 1 pg Plasmid-DNA. Déi optimal Quantitéit hänkt gréisstendeels vun der Unzuel vun de Kopie vun der Zilsequenz, souwéi vun hirer Komplexitéit of.
Wann ganz wéineg Schabloun benotzt gëtt, ass eng entspriechend Erhéijung vun der Unzuel vun Amplifikatiounszyklen néideg fir eng ausreechend Quantitéit u Produkt ze kréien. Eng Taq-Polymerase, déi fir déi meescht PCR-Experimenter benotzt gëtt, huet keng Korrekturfunktioun (3'-5' Exonukleaseaktivitéit); dofir kënnen Feeler, déi während der Amplifikatioun optrieden, net korrigéiert ginn. Wat méi héich d'Zuel vun de Zyklen ass, wat méi heefeg d'Amplifikatioun vum fehlerhafte Produkt ass. Wann op der anerer Säit d'Quantitéit vun der Schabloun ze héich ass, klëmmt d'Wahrscheinlechkeet, datt Primer un aner (net honnertprozenteg komplementär) Sequenzen annealen, souwéi d'Bildung vu Primerdimeren, wat zu der Amplifikatioun vu Nieweprodukter féiert. A ville Fäll gëtt DNA aus Zellkulturen oder vu Mikroorganismen isoléiert an duerno als PCR-Schabloun benotzt. No der Reinigung ass et néideg d'Konzentratioun vun der DNA ze bestëmmen, fir de Volumen ze definéieren, deen fir den PCR-Setup erfuerderlech ass. Wärend d'Agarosegelelektrophorese eng Schätzung ka ginn, ass dës Method wäit vun präzis. UV-Vis-Spektrophotometrie gouf als Goldstandard fir d'Quantifizéierung vun Nukleinsäuren etabléiert; Dës direkt an dofir einfach a séier Method moosst d'Absorptioun vun der Prouf bei 260 nm, an d'Konzentratioun gëtt mat Hëllef vun engem Konversiounsfaktor berechent.
Wann d'DNA-Konzentratioun awer ganz niddreg ass (< 1 µg/mL dsDNA), oder wann se mat Substanzen kontaminéiert ass, déi och am 260 nm Beräich absorbéieren (z.B. RNA, Protein, Salzer), erreecht dës Method hir Grenzen. Am Fall vu ganz niddrege Konzentratioune ginn d'Miessunge séier ze ongenau fir nëtzlech ze sinn, a Kontaminatioune féieren zu enger (heiansdo enormer) Iwwerschätzung vum tatsächleche Wäert. An dësem Fall kann d'Quantifizéierung mat Hëllef vu Fluoreszenz eng Alternativ sinn. Dës Technik baséiert op der Notzung vun engem fluoreszenten Faarfstoff, deen spezifesch un dsDNA bindt - nëmmen de Komplex, deen aus Nukleinsäure a Faarfstoff besteet, gëtt vum Liicht ugereegt, an et wäert duerno Liicht mat enger liicht méi héijer Wellelängt emittéieren. Hei ass d'Intensitéit vum fluoreszenten Signal proportional zu der Quantitéit vun der DNA, a fir d'Bestimmung vun der Konzentratioun gëtt se a Bezuch op eng Standardkurve evaluéiert. D'Virdeeler vun dëser Method baséieren op der Spezifizitéit vun der Bindung, déi déi extern Aflëss ausschléisst, déi duerch Kontaminatioun agefouert ginn, souwéi op der resultéierender Fäegkeet, ganz niddreg Konzentratioune vun DNA z'entdecken. D'Gëeegentheet vun enger vun de Methoden hänkt haaptsächlech vun der Proufkonzentratioun an der Rengheet of; A ville Fäll kann et souguer ubruecht sinn, béid Methoden parallel anzewenden.
Zäitpunkt vun der Verëffentlechung: 30. November 2022