Her çend di teorîyê de, molekulek şablonê têrê bike jî, bi gelemperî ji bo PCR-ya klasîk mîqdarên pir mezintir ên DNA-yê têne bikar anîn, mînakî, heta 1 µg DNA-ya memikên genomîk û bi tenê 1 pg DNA-ya plazmîdê. Mîqdara çêtirîn bi giranî bi hejmara kopiyên rêza hedef, û her weha bi tevliheviya wê ve girêdayî ye.
Eger pir kêm şablon were bikaranîn, ji bo bidestxistina mîqdarek têr a berhemê, zêdebûnek beramber di hejmara çerxên amplîfîkasyonê de dê hewce be. Polîmerazek Taq ku ji bo piraniya ceribandinên PCR tê bikaranîn, fonksiyonek sererastkirinê nîşan nade (çalakiya eksonukleazê 3′-5′); ji ber vê yekê, xeletiyên ku di dema amplîfîkasyonê de çêdibin nayên sererastkirin. Hejmara çerxan çiqas zêde be, amplîfîkasyona berhema xelet dê ewqas belavtir be. Ji hêla din ve, heke mîqdara şablonê pir zêde be, îhtîmala germkirina primeran bi rêzikên din (ne sedî sed temamker), û her weha avakirina dîmerên primeran, dê zêde bibe, ku dê bibe sedema amplîfîkasyona berhemên alî. Di gelek rewşan de, DNA ji çandên hucreyê an ji mîkroorganîzmayan tê veqetandin û paşê wekî şablonek PCR tê bikar anîn. Piştî paqijkirinê, pêdivî ye ku konsantrasyona DNA were destnîşankirin da ku bikaribe qebareya ku ji bo sazkirina PCR-ê hewce ye diyar bike. Her çend elektroforeza jela agarozê dikare ji bo peyda kirina texmînek xizmet bike jî, ev rêbaz ji rastbûnê dûr e. Spektrofotometriya UV-Vis wekî standarda zêrîn ji bo pîvandina asîdên nukleîk hatiye saz kirin; Ev rêbaza rasterast û ji ber vê yekê hêsan û bilez vegirtina nimûneyê li 260 nm dipîve, û konsantrasyon bi alîkariya faktorek veguherînê tê hesibandin.
Lêbelê, heke rêjeya DNAyê pir kêm be (< 1 µg/mL dsDNA), an jî heke ew bi madeyên ku di rêza 260 nm de jî têne kişandin (mînak RNA, proteîn, xwê) qirêj bibe, ev rêbaz dê bigihîje sînorên xwe. Di rewşa rêjeya pir kêm de, xwendin dê zû pir xelet bibin ku bikar neyên, û qirêjbûn dê bibe sedema zêde texmînkirina (carinan pir mezin) ya nirxa rastîn. Di vê rewşê de, pîvandina bi karanîna fluoresansê dikare alternatîfek pêşkêş bike. Ev teknîk li ser karanîna boyaxek fluoresansê ye ku bi taybetî bi dsDNA ve girêdide, tenê kompleksa ku ji asîda nukleîk û boyaxê pêk tê ji hêla ronahiyê ve tê teşwîq kirin, û ew ê paşê ronahiya dirêjahiya pêlê ya hinekî bilindtir derxe. Li vir, şîdeta sînyala fluoresansê bi mîqdara DNAyê re rêjeyî ye, û ji bo destnîşankirina rêjeya wê ew li gorî xêzek standard tê nirxandin. Awantajên vê rêbazê li ser taybetmendiya girêdanê ne, ku bandorên derveyî yên ku ji hêla qirêjbûnê ve têne çêkirin derdixe, û her weha li ser şiyana encam a tespîtkirina rêjeyan pir kêm a DNAyê. Guncawbûna her du rêbazan bi giranî bi rêjeya nimûneyê û paqijiyê ve girêdayî ye; di gelek rewşan de dibe ku heta şîret be ku her du rêbaz bi hev re werin sepandin.
Dema weşandinê: 30 Mijdar-2022