이론상으로는 주형 분자 하나면 충분하지만, 고전적인 PCR에는 일반적으로 훨씬 더 많은 양의 DNA가 사용됩니다. 예를 들어, 포유류 유전체 DNA는 최대 1µg, 플라스미드 DNA는 최소 1pg 정도입니다. 최적의 양은 표적 서열의 복제 수와 복잡성에 따라 크게 달라집니다.
매우 적은 양의 주형을 사용하는 경우, 충분한 양의 생성물을 얻기 위해 증폭 사이클 횟수를 그에 맞게 늘려야 합니다. 대부분의 PCR 실험에 사용되는 Taq 중합효소는 보정 기능(3'-5' 엑소뉴클레아제 활성)을 가지고 있지 않습니다. 따라서 증폭 중 발생하는 오류는 보정할 수 없습니다. 사이클 횟수가 많을수록 결함 있는 생성물의 증폭이 더 빈번해집니다. 반면, 주형의 양이 너무 많으면 프라이머가 다른(100% 상보적이지 않은) 서열에 어닐링될 가능성이 높아지고 프라이머 다이머가 형성되어 부산물이 증폭될 수 있습니다. 많은 경우, 세포 배양액이나 미생물에서 DNA를 분리하여 PCR 주형으로 사용합니다. 정제 후에는 PCR 설정에 필요한 용량을 결정하기 위해 DNA의 농도를 측정해야 합니다. 아가로스 겔 전기영동을 통해 추정치를 얻을 수 있지만, 이 방법은 정확하지 않습니다. UV-Vis 분광법은 핵산 정량화의 황금 표준으로 자리 잡았습니다. 이 직접적이고 쉽고 빠른 방법은 260nm에서 샘플의 흡광도를 측정하고 농도는 변환 계수의 도움으로 계산됩니다.
그러나 DNA 농도가 매우 낮거나(< 1 µg/mL dsDNA) 260nm 범위에서도 흡수하는 물질(예: RNA, 단백질, 염)로 오염된 경우, 이 방법은 한계에 도달합니다. 농도가 매우 낮은 경우, 측정값은 곧 너무 부정확해져 쓸모가 없게 되고, 오염으로 인해 실제 값을 (때로는 엄청나게) 과대평가하게 됩니다. 이 경우 형광을 이용한 정량이 대안이 될 수 있습니다. 이 기술은 dsDNA에 특이적으로 결합하는 형광 염료를 사용하여 핵산과 염료로 구성된 복합체만 빛에 의해 여기되고, 이후 약간 더 높은 파장의 빛을 방출합니다. 이 경우, 형광 신호의 강도는 DNA 양에 비례하며, 농도를 결정하기 위해 표준 곡선과 비교하여 평가합니다. 이 방법의 장점은 오염으로 인한 외부 영향을 배제하는 결합의 특이성과 매우 낮은 농도의 DNA를 검출할 수 있는 능력에 있습니다. 두 방법의 적합성은 주로 샘플 농도와 순도에 따라 달라집니다. 많은 경우 두 방법을 병행해서 적용하는 것이 좋을 수도 있습니다.
게시 시간: 2022년 11월 30일