რამდენი შაბლონი უნდა დავამატო ჩემს PCR რეაქციას?

მიუხედავად იმისა, რომ თეორიულად, შაბლონის ერთი მოლეკულა საკმარისი იქნებოდა, კლასიკური პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის (PCR) დროს, როგორც წესი, გამოიყენება დნმ-ის გაცილებით დიდი რაოდენობა, მაგალითად, გენომური ძუძუმწოვრების დნმ-ის 1 მკგ-მდე და პლაზმური დნმ-ის მხოლოდ 1 პგ-მდე. ოპტიმალური რაოდენობა დიდწილად დამოკიდებულია სამიზნე თანმიმდევრობის ასლების რაოდენობაზე, ასევე მის სირთულეზე.

თუ ძალიან მცირე რაოდენობის შაბლონი გამოიყენება, პროდუქტის საკმარისი რაოდენობის მისაღებად საჭირო იქნება ამპლიფიკაციის ციკლების რაოდენობის შესაბამისი ზრდა. Taq პოლიმერაზა, რომელიც გამოიყენება PCR ექსპერიმენტების უმეტესობისთვის, არ გააჩნია კორექციის ფუნქცია (3′-5′ ეგზონუკლეაზის აქტივობა); ამრიგად, ამპლიფიკაციის დროს წარმოქმნილი შეცდომების გამოსწორება შეუძლებელია. რაც უფრო მეტია ციკლების რაოდენობა, მით უფრო გავრცელებული იქნება დეფექტური პროდუქტის ამპლიფიკაცია. მეორეს მხრივ, თუ შაბლონის რაოდენობა ძალიან მაღალია, გაიზრდება პრაიმერების სხვა (არა ასი პროცენტით კომპლემენტარული) თანმიმდევრობებთან გახურების ალბათობა, ასევე პრაიმერის დიმერების წარმოქმნის ალბათობა, რაც გამოიწვევს თანმდევი პროდუქტების ამპლიფიკაციას. ბევრ შემთხვევაში, დნმ იზოლირებულია უჯრედული კულტურებიდან ან მიკროორგანიზმებიდან და შემდგომში გამოიყენება PCR შაბლონად. გაწმენდის შემდეგ, აუცილებელია დნმ-ის კონცენტრაციის დადგენა, რათა განისაზღვროს PCR-ის დაყენებისთვის საჭირო მოცულობა. მიუხედავად იმისა, რომ აგაროზული გელის ელექტროფორეზი შეიძლება შეფასების საშუალებას იძლეოდეს, ეს მეთოდი ზუსტი არ არის. UV-Vis სპექტროფოტომეტრია დამკვიდრდა, როგორც ოქროს სტანდარტი ნუკლეინის მჟავების რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის; ეს პირდაპირი და შესაბამისად მარტივი და სწრაფი მეთოდი ზომავს ნიმუშის შთანთქმას 260 ნმ-ზე, ხოლო კონცენტრაცია გამოითვლება გარდაქმნის კოეფიციენტის დახმარებით.

თუმცა, თუ დნმ-ის კონცენტრაცია ძალიან დაბალია (< 1 მკგ/მლ dsDNA), ან თუ ის დაბინძურებულია ნივთიერებებით, რომლებიც ასევე შეიწოვება 260 ნმ დიაპაზონში (მაგ. რნმ, ცილა, მარილები), ეს მეთოდი მიაღწევს თავის შეზღუდვებს. ძალიან დაბალი კონცენტრაციების შემთხვევაში, ჩვენებები მალე ძალიან არაზუსტი გახდება გამოსაყენებლად და დაბინძურება გამოიწვევს ფაქტობრივი მნიშვნელობის (ზოგჯერ უზარმაზარ) გადაჭარბებულ შეფასებას. ამ შემთხვევაში, ფლუორესცენციის გამოყენებით რაოდენობრივი განსაზღვრა შეიძლება წარმოადგენდეს ალტერნატივას. ეს ტექნიკა ეფუძნება ფლუორესცენტული საღებავის გამოყენებას, რომელიც სპეციფიკურად უკავშირდება dsDNA-ს, მხოლოდ ნუკლეინის მჟავასა და საღებავისგან შემდგარი კომპლექსი აღიგზნება სინათლით და შემდგომში გამოყოფს ოდნავ უფრო მაღალი ტალღის სიგრძის სინათლეს. აქ, ფლუორესცენტული სიგნალის ინტენსივობა პროპორციულია დნმ-ის რაოდენობისა და კონცენტრაციის დასადგენად ის შეფასებულია სტანდარტულ მრუდთან მიმართებაში. ამ მეთოდის უპირატესობები ეფუძნება ბმის სპეციფიკურობას, რომელიც გამორიცხავს დაბინძურებით გამოწვეულ გარე გავლენას, ასევე დნმ-ის ძალიან დაბალი კონცენტრაციების აღმოჩენის შედეგად მიღებულ უნარს. ორივე მეთოდის შესაფერისობა ძირითადად დამოკიდებულია ნიმუშის კონცენტრაციასა და სისუფთავეზე; ბევრ შემთხვევაში, შესაძლოა, ორივე მეთოდის პარალელურად გამოყენებაც კი იყოს მიზანშეწონილი.