Չնայած տեսականորեն ձևանմուշի մեկ մոլեկուլը բավարար կլինի, դասական ՊՇՌ-ի համար սովորաբար օգտագործվում են զգալիորեն ավելի մեծ քանակությամբ ԴՆԹ-ներ, օրինակ՝ մինչև 1 մկգ գենոմային կաթնասունների ԴՆԹ և ընդամենը 1 պկգ պլազմիդային ԴՆԹ: Օպտիմալ քանակը մեծապես կախված է թիրախային հաջորդականության պատճենների քանակից, ինչպես նաև դրա բարդությունից:
Եթե շատ քիչ ձևանմուշ է օգտագործվում, ապա բավարար քանակությամբ արտադրանք ստանալու համար անհրաժեշտ կլինի ամպլիֆիկացման ցիկլերի քանակի համապատասխան աճ: ՊՇՌ փորձերի մեծ մասի համար օգտագործվող Taq պոլիմերազը չունի ուղղման ֆունկցիա (3′-5′ էկզոնուկլեազային ակտիվություն). հետևաբար, ամպլիֆիկացման ընթացքում առաջացող սխալները չեն կարող շտկվել: Որքան մեծ է ցիկլերի քանակը, այնքան ավելի տարածված կլինի թերի արտադրանքի ամպլիֆիկացումը: Մյուս կողմից, եթե ձևանմուշի քանակը չափազանց բարձր է, կաճի պրայմերների այլ (ոչ հարյուր տոկոսով լրացուցիչ) հաջորդականություններին թրծելու, ինչպես նաև պրայմերների դիմերների առաջացման հավանականությունը, ինչը կհանգեցնի ենթամթերքների ամպլիֆիկացման: Շատ դեպքերում ԴՆԹ-ն մեկուսացվում է բջջային կուլտուրաներից կամ միկրոօրգանիզմներից և հետագայում օգտագործվում է որպես ՊՇՌ ձևանմուշ: Մաքրումից հետո անհրաժեշտ է որոշել ԴՆԹ-ի կոնցենտրացիան՝ ՊՇՌ կարգավորման համար անհրաժեշտ ծավալը սահմանելու համար: Չնայած ագարոզային գելի էլեկտրոֆորեզը կարող է ծառայել գնահատական տալու համար, այս մեթոդը հեռու է ճշգրիտ լինելուց: UV-Vis սպեկտրոֆոտոմետրիան հաստատվել է որպես նուկլեինաթթուների քանակական որոշման ոսկե ստանդարտ. Այս ուղղակի և, հետևաբար, հեշտ ու արագ մեթոդը չափում է նմուշի կլանումը 260 նմ-ում, իսկ կոնցենտրացիան հաշվարկվում է փոխակերպման գործակցի օգնությամբ։
Սակայն, եթե ԴՆԹ-ի կոնցենտրացիան շատ ցածր է (< 1 մկգ/մլ դդդ.), կամ եթե այն աղտոտված է նյութերով, որոնք նույնպես ներծծվում են 260 նմ տիրույթում (օրինակ՝ ՌՆԹ, սպիտակուց, աղեր), այս մեթոդը կհասնի իր սահմանափակումներին։ Շատ ցածր կոնցենտրացիաների դեպքում ցուցմունքները շուտով կդառնան չափազանց անճշտություններ օգտագործելու համար, և աղտոտումները կհանգեցնեն իրական արժեքի (երբեմն հսկայական) գերագնահատման։ Այս դեպքում ֆլուորեսցենցիայի միջոցով քանակական որոշումը կարող է ներկայացնել այլընտրանք։ Այս տեխնիկան հիմնված է ֆլուորեսցենտ ներկանյութի օգտագործման վրա, որը հատուկ կապվում է դդդ.-ի հետ, միայն նուկլեինաթթու և ներկանյութ պարունակող համալիրն է գրգռվում լույսով, և այն հետագայում կարձակի մի փոքր ավելի բարձր ալիքի երկարության լույս։ Այստեղ ֆլուորեսցենտային ազդանշանի ինտենսիվությունը համեմատական է ԴՆԹ-ի քանակին, և կոնցենտրացիան որոշելու համար այն գնահատվում է ստանդարտ կորի նկատմամբ։ Այս մեթոդի առավելությունները հիմնված են կապի առանձնահատկության վրա, որը բացառում է աղտոտման հետևանքով ներմուծված արտաքին ազդեցությունները, ինչպես նաև ԴՆԹ-ի շատ ցածր կոնցենտրացիաները հայտնաբերելու արդյունքում առաջացող ունակության վրա։ Երկու մեթոդների պիտանիությունը հիմնականում կախված է նմուշի կոնցենտրացիայից և մաքրությունից։ շատ դեպքերում նույնիսկ կարող է խորհուրդ տրվել երկու մեթոդներն էլ զուգահեռաբար կիրառել։
Հրապարակման ժամանակը. Նոյեմբերի 30-2022