ભલે સિદ્ધાંતમાં, નમૂનાનો એક પરમાણુ પૂરતો હશે, ક્લાસિક PCR માટે નોંધપાત્ર રીતે મોટી માત્રામાં DNAનો ઉપયોગ થાય છે, ઉદાહરણ તરીકે, 1 µg સુધીનો જીનોમિક સસ્તન પ્રાણી DNA અને 1 pg જેટલું ઓછું પ્લાઝમિડ DNA. શ્રેષ્ઠ રકમ મોટે ભાગે લક્ષ્ય ક્રમની નકલોની સંખ્યા તેમજ તેની જટિલતા પર આધાર રાખે છે.
જો ખૂબ જ ઓછા ટેમ્પ્લેટનો ઉપયોગ કરવામાં આવે, તો પૂરતી માત્રામાં ઉત્પાદન મેળવવા માટે એમ્પ્લીફિકેશન ચક્રની સંખ્યામાં અનુરૂપ વધારો કરવાની જરૂર પડશે. મોટાભાગના પીસીઆર પ્રયોગો માટે ઉપયોગમાં લેવાતા ટેક પોલિમરેઝમાં કરેક્શન ફંક્શન (3′-5′ એક્સોન્યુક્લીઝ પ્રવૃત્તિ) હોતું નથી; આમ, એમ્પ્લીફિકેશન દરમિયાન થતી ભૂલોને સુધારી શકાતી નથી. ચક્રની સંખ્યા જેટલી વધારે હશે, ખામીયુક્ત ઉત્પાદનનું એમ્પ્લીફિકેશન વધુ પ્રચલિત થશે. બીજી બાજુ, જો ટેમ્પ્લેટનું પ્રમાણ ખૂબ વધારે હશે, તો પ્રાઈમર્સને અન્ય (સો ટકા પૂરક નહીં) સિક્વન્સમાં એન્નીલ કરવાની સંભાવના, તેમજ પ્રાઈમર ડાઇમર્સની રચના વધશે, જેના પરિણામે બાય-પ્રોડક્ટ્સનું એમ્પ્લીફિકેશન થશે. ઘણા કિસ્સાઓમાં, ડીએનએને સેલ કલ્ચર અથવા સુક્ષ્મસજીવોથી અલગ કરવામાં આવે છે અને ત્યારબાદ પીસીઆર ટેમ્પ્લેટ તરીકે ઉપયોગમાં લેવાય છે. શુદ્ધિકરણ પછી, પીસીઆર સેટઅપ માટે જરૂરી વોલ્યુમ વ્યાખ્યાયિત કરવા માટે ડીએનએની સાંદ્રતા નક્કી કરવી જરૂરી છે. જ્યારે એગારોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ અંદાજ પૂરો પાડવા માટે સેવા આપી શકે છે, આ પદ્ધતિ સચોટ નથી. ન્યુક્લિક એસિડના જથ્થાત્મકકરણ માટે યુવી-વિઝ સ્પેક્ટ્રોફોટોમેટ્રીને સુવર્ણ માનક તરીકે સ્થાપિત કરવામાં આવ્યું છે; આ સીધી અને તેથી સરળ અને ઝડપી પદ્ધતિ 260 nm પર નમૂનાના શોષણને માપે છે, અને સાંદ્રતાની ગણતરી રૂપાંતર પરિબળની મદદથી કરવામાં આવે છે.
જો DNA સાંદ્રતા ખૂબ ઓછી હોય, તો (< 1 µg/mL dsDNA), અથવા જો તે 260 nm શ્રેણીમાં શોષી લેતા પદાર્થો (દા.ત. RNA, પ્રોટીન, ક્ષાર) થી દૂષિત હોય, તો આ પદ્ધતિ તેની મર્યાદા સુધી પહોંચી જશે. ખૂબ ઓછી સાંદ્રતાના કિસ્સામાં, વાંચન ટૂંક સમયમાં ઉપયોગમાં લેવા માટે ખૂબ જ અચોક્કસ બની જશે, અને દૂષણો વાસ્તવિક મૂલ્યના (ક્યારેક પ્રચંડ) અતિશય અંદાજ તરફ દોરી જશે. આ કિસ્સામાં, ફ્લોરોસેન્સનો ઉપયોગ કરીને પરિમાણીકરણ એક વિકલ્પ રજૂ કરી શકે છે. આ તકનીક ફ્લોરોસન્ટ રંગના ઉપયોગ પર આધારિત છે જે ખાસ કરીને dsDNA સાથે જોડાય છે, ફક્ત ન્યુક્લિક એસિડ અને રંગ ધરાવતા સંકુલ પ્રકાશ દ્વારા ઉત્તેજિત થાય છે, અને તે પછીથી થોડી વધારે તરંગલંબાઇનો પ્રકાશ ઉત્સર્જિત કરશે. અહીં, ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલની તીવ્રતા DNA ની માત્રાના પ્રમાણસર છે, અને સાંદ્રતા નક્કી કરવા માટે તેનું મૂલ્યાંકન પ્રમાણભૂત વળાંકના સંબંધમાં કરવામાં આવે છે. આ પદ્ધતિના ફાયદા બોન્ડની વિશિષ્ટતા પર આધારિત છે, જે દૂષણ દ્વારા રજૂ કરાયેલા બાહ્ય પ્રભાવોને બાકાત રાખે છે, તેમજ DNA ની ખૂબ ઓછી સાંદ્રતા શોધવાની પરિણામી ક્ષમતા પર આધારિત છે. કોઈપણ પદ્ધતિની યોગ્યતા મુખ્યત્વે નમૂનાની સાંદ્રતા અને શુદ્ધતા પર આધાર રાખે છે; ઘણા કિસ્સાઓમાં બંને પદ્ધતિઓને સમાંતર રીતે લાગુ કરવાની પણ સલાહ આપવામાં આવે છે.
પોસ્ટ સમય: નવેમ્બર-૩૦-૨૦૨૨