Aínda que en teoría unha molécula do molde sería suficiente, normalmente utilízanse cantidades de ADN considerablemente maiores para unha PCR clásica, por exemplo, ata 1 µg de ADN xenómico de mamífero e tan só 1 pg de ADN plasmídico. A cantidade óptima depende en gran medida do número de copias da secuencia diana, así como da súa complexidade.
Se se usa moi pouco molde, será necesario un aumento correspondente no número de ciclos de amplificación para obter unha cantidade suficiente de produto. Unha Taq polimerase que se usa para a maioría dos experimentos de PCR non presenta unha función de corrección (actividade exonuclease 3′-5′); polo tanto, os erros que se producen durante a amplificación non se poden corrixir. Canto maior sexa o número de ciclos, maior será a prevalencia da amplificación do produto defectuoso. Se, pola contra, a cantidade de molde é demasiado alta, aumentará a probabilidade de que os cebadores se hibriden con outras secuencias (non complementarias ao cen por cen), así como a formación de dímeros de cebadores, o que resultará na amplificación de subprodutos. En moitos casos, o ADN íllase de cultivos celulares ou de microorganismos e posteriormente úsase como molde de PCR. Despois da purificación, é necesario determinar a concentración do ADN para poder definir o volume que se require para a configuración da PCR. Aínda que a electroforese en xel de ágarosa pode servir para proporcionar unha estimación, este método está lonxe de ser preciso. A espectrofotometría UV-Vis estableceuse como o estándar de ouro para a cuantificación de ácidos nucleicos; Este método directo e, polo tanto, sinxelo e rápido mide a absorbancia da mostra a 260 nm e a concentración calcúlase coa axuda dun factor de conversión.
Non obstante, se a concentración de ADN é moi baixa (< 1 µg/mL de ADN bicatenario) ou se está contaminado con substancias que tamén absorben no rango de 260 nm (por exemplo, ARN, proteínas, sales), este método alcanzará as súas limitacións. No caso de concentracións moi baixas, as lecturas axiña se volverán demasiado imprecisas para ser útiles e as contaminacións levarán a unha sobreestimación (ás veces enorme) do valor real. Neste caso, a cuantificación mediante fluorescencia pode presentar unha alternativa. Esta técnica baséase no uso dun colorante fluorescente que se une especificamente ao ADN bicatenario; só o complexo que comprende o ácido nucleico e o colorante é excitado pola luz e, posteriormente, emitirá luz dunha lonxitude de onda lixeiramente superior. Aquí, a intensidade do sinal fluorescente é proporcional á cantidade de ADN e, para determinar a concentración, avalíase en relación cunha curva estándar. As vantaxes deste método residen na especificidade da unión, que exclúe as influencias externas introducidas pola contaminación, así como na capacidade resultante de detectar concentracións moi baixas de ADN. A idoneidade de calquera dos métodos depende principalmente da concentración e pureza da mostra; en moitos casos pode incluso ser aconsellable aplicar ambos os métodos en paralelo.
Data de publicación: 30 de novembro de 2022