Cé go mbeadh móilín amháin den teimpléad leordhóthanach sa teoiric, úsáidtear méideanna i bhfad níos mó de DNA de ghnáth le haghaidh PCR clasaiceach, mar shampla, suas le 1 µg de DNA mamaigh gheanómach agus chomh beag le 1 pg de DNA plasmíde. Braitheann an méid is fearr den chuid is mó ar líon na gcóipeanna den seicheamh sprice, chomh maith le ar a chastacht.
Mura n-úsáidtear mórán teimpléid, beidh gá le méadú comhfhreagrach ar líon na dtimthriallta aimplithe chun méid leordhóthanach den táirge a fháil. Níl feidhm cheartúcháin (gníomhaíocht eiséinicléáise 3′-5′) ag polaiméaráis Taq a úsáidtear don chuid is mó de thurgnaimh PCR; dá bhrí sin, ní féidir earráidí a tharlaíonn le linn aimplithe a cheartú. Dá airde líon na dtimthriallta, is ea is forleithne a bheidh aimpliú an táirge lochtaigh. Ar an láimh eile, má tá méid an teimpléid ró-ard, méadóidh an dóchúlacht go n-ainéalóidh tosaitheoirí le seichimh eile (nach comhlántach céad faoin gcéad), chomh maith le foirmiú démhéirí tosaitheoirí, rud a fhágfaidh aimpliú fotháirgí mar thoradh air. I go leor cásanna, déantar DNA a leithlisiú ó chultúir chealla nó ó mhiocrorgánaigh agus úsáidtear é ina dhiaidh sin mar theimpléad PCR. Tar éis íonúcháin, is gá tiúchan an DNA a chinneadh chun an toirt atá ag teastáil don socrú PCR a shainiú. Cé gur féidir le leictreafóiréis glóthach agaróise meastachán a sholáthar, tá an modh seo i bhfad ó bheith cruinn. Tá speictreafótaiméadracht UV-Vis bunaithe mar an caighdeán óir chun aigéid núicléasacha a chainníochtú; Tomhaiseann an modh díreach agus dá bhrí sin éasca agus tapa seo ionsú an tsampla ag 260 nm, agus ríomhtar an tiúchan le cabhair ó fhachtóir comhshó.
Má tá tiúchan an DNA an-íseal, áfach (< 1 µg/mL dsDNA), nó má tá sé éillithe le substaintí a ionsúnn sa raon 260 nm freisin (m.sh. RNA, próitéin, salainn), sroichfidh an modh seo a theorainneacha. I gcás tiúchan an-íseal, beidh na léamha ró-mhíchruinn go luath le bheith úsáideach, agus beidh rómheastachán (uaireanta ollmhór) ar an luach iarbhír mar thoradh ar éillithe. Sa chás seo, d'fhéadfadh cainníochtú ag baint úsáide as fluaraiseacht rogha eile a chur i láthair. Tá an teicníc seo bunaithe ar úsáid ruaime fluaraiseach a cheanglaíonn go sonrach le dsDNA agus ní spreagann an solas ach an coimpléasc ina bhfuil aigéad núicléasach agus ruaim, agus ina dhiaidh sin astóidh sé solas de thonnfhad beagán níos airde. Anseo, tá déine an chomhartha fluaraiseach comhréireach le méid an DNA, agus chun an tiúchan a chinneadh déantar é a mheas i ndáil le cuar caighdeánach. Braitheann buntáistí an mhodha seo ar shonrúlacht an naisc, rud a fhágann nach n-áirítear na tionchair sheachtracha a thugtar isteach de bharr éillithe, chomh maith leis an gcumas mar thoradh air sin tiúchain an-íseal de DNA a bhrath. Braitheann oiriúnacht ceachtar modh den chuid is mó ar thiúchan agus íonacht an tsampla; i go leor cásanna, b’fhéidir go mbeadh sé inmholta fiú an dá mhodh a chur i bhfeidhm go comhthreomhar.
Am an phoist: 30 Samhain 2022