Même si, en théorie, une seule molécule de matrice serait suffisante, des quantités d'ADN bien plus importantes sont généralement utilisées pour une PCR classique, par exemple jusqu'à 1 µg d'ADN génomique de mammifère et seulement 1 pg d'ADN plasmidique. La quantité optimale dépend largement du nombre de copies de la séquence cible, ainsi que de sa complexité.
Si la matrice utilisée est très faible, une augmentation correspondante du nombre de cycles d'amplification sera nécessaire pour obtenir une quantité suffisante de produit. La Taq polymérase utilisée pour la plupart des expériences de PCR ne dispose pas de fonction de correction (activité exonucléase 3'-5') ; les erreurs survenant lors de l'amplification ne peuvent donc pas être corrigées. Plus le nombre de cycles est élevé, plus l'amplification de produits défectueux sera fréquente. En revanche, si la quantité de matrice est trop élevée, la probabilité d'hybridation des amorces à d'autres séquences (non totalement complémentaires) et la formation de dimères d'amorces augmenteront, ce qui entraînera l'amplification de sous-produits. Dans de nombreux cas, l'ADN est isolé de cultures cellulaires ou de micro-organismes, puis utilisé comme matrice de PCR. Après purification, il est nécessaire de déterminer la concentration d'ADN afin de définir le volume requis pour la configuration de la PCR. Bien que l'électrophorèse sur gel d'agarose puisse fournir une estimation, cette méthode est loin d'être précise. La spectrophotométrie UV-Vis a été établie comme la référence pour la quantification des acides nucléiques ; cette méthode directe et donc simple et rapide mesure l'absorbance de l'échantillon à 260 nm, et la concentration est calculée à l'aide d'un facteur de conversion.
Cependant, si la concentration d'ADN est très faible (< 1 µg/mL d'ADNdb), ou si elle est contaminée par des substances absorbant également dans la gamme des 260 nm (par exemple, ARN, protéines, sels), cette méthode atteint ses limites. Dans le cas de concentrations très faibles, les mesures deviennent rapidement trop imprécises pour être exploitables, et les contaminations entraînent une surestimation (parfois considérable) de la valeur réelle. Dans ce cas, la quantification par fluorescence peut constituer une alternative. Cette technique repose sur l'utilisation d'un colorant fluorescent qui se lie spécifiquement à l'ADNdb : seul le complexe acide nucléique-colorant est excité par la lumière et émet ensuite une lumière d'une longueur d'onde légèrement supérieure. Dans ce cas, l'intensité du signal fluorescent est proportionnelle à la quantité d'ADN ; pour déterminer la concentration, elle est évaluée par rapport à une courbe standard. Les avantages de cette méthode résident dans la spécificité de la liaison, qui exclut les influences externes introduites par la contamination, ainsi que dans la capacité qui en résulte à détecter de très faibles concentrations d'ADN. L’adéquation de l’une ou l’autre méthode dépend principalement de la concentration et de la pureté de l’échantillon ; dans de nombreux cas, il peut même être conseillé d’appliquer les deux méthodes en parallèle.
Date de publication : 30 novembre 2022