چه مقدار الگو باید به واکنش PCR اضافه کنیم؟

اگرچه از نظر تئوری، یک مولکول الگو کافی است، اما معمولاً مقادیر بسیار بیشتری از DNA برای PCR کلاسیک استفاده می‌شود، به عنوان مثال، تا ۱ میکروگرم از DNA ژنومی پستانداران و به کمی ۱ پیکوگرم از DNA پلاسمید. مقدار بهینه تا حد زیادی به تعداد کپی‌های توالی هدف و همچنین پیچیدگی آن بستگی دارد.

اگر از الگوی بسیار کمی استفاده شود، برای به دست آوردن مقدار کافی محصول، افزایش متناظر در تعداد چرخه‌های تکثیر مورد نیاز خواهد بود. یک پلیمراز Taq که برای اکثر آزمایش‌های PCR استفاده می‌شود، دارای عملکرد تصحیح (فعالیت اگزونوکلئازی ۳′-۵′) نیست؛ بنابراین، خطاهایی که در طول تکثیر رخ می‌دهند قابل اصلاح نیستند. هرچه تعداد چرخه‌ها بیشتر باشد، تکثیر محصول ناقص شایع‌تر خواهد بود. از سوی دیگر، اگر مقدار الگو خیلی زیاد باشد، احتمال اتصال پرایمرها به توالی‌های دیگر (که صد در صد مکمل هم نیستند) و همچنین تشکیل دایمرهای پرایمر افزایش می‌یابد که منجر به تکثیر محصولات جانبی می‌شود. در بسیاری از موارد، DNA از کشت‌های سلولی یا از میکروارگانیسم‌ها جدا شده و متعاقباً به عنوان الگوی PCR استفاده می‌شود. پس از خالص‌سازی، لازم است غلظت DNA تعیین شود تا بتوان حجم مورد نیاز برای راه‌اندازی PCR را تعیین کرد. در حالی که الکتروفورز ژل آگارز ممکن است برای ارائه تخمین مفید باشد، این روش به هیچ وجه دقیق نیست. طیف‌سنجی فرابنفش-مرئی (UV-Vis) به عنوان استاندارد طلایی برای تعیین مقدار اسیدهای نوکلئیک تعیین شده است؛ این روش مستقیم و بنابراین آسان و سریع، جذب نمونه را در طول موج 260 نانومتر اندازه‌گیری می‌کند و غلظت با کمک یک ضریب تبدیل محاسبه می‌شود.

با این حال، اگر غلظت DNA بسیار کم باشد (کمتر از 1 میکروگرم در میلی‌لیتر dsDNA)، یا اگر با موادی که در محدوده 260 نانومتر نیز جذب می‌کنند (مانند RNA، پروتئین، نمک‌ها) آلوده شده باشد، این روش به محدودیت‌های خود خواهد رسید. در مورد غلظت‌های بسیار کم، قرائت‌ها به زودی بسیار نادرست می‌شوند و قابل استفاده نخواهند بود و آلودگی‌ها منجر به تخمین بیش از حد (گاهی اوقات بسیار زیاد) مقدار واقعی می‌شوند. در این حالت، تعیین مقدار با استفاده از فلورسانس می‌تواند جایگزین مناسبی باشد. این تکنیک مبتنی بر استفاده از یک رنگ فلورسنت است که به طور خاص به dsDNA متصل می‌شود، تنها کمپلکس متشکل از اسید نوکلئیک و رنگ توسط نور برانگیخته می‌شود و متعاقباً نوری با طول موج کمی بالاتر ساطع می‌کند. در اینجا، شدت سیگنال فلورسنت متناسب با مقدار DNA است و برای تعیین غلظت، نسبت به یک منحنی استاندارد ارزیابی می‌شود. مزایای این روش بر ویژگی پیوند، که تأثیرات خارجی ناشی از آلودگی را حذف می‌کند، و همچنین بر توانایی حاصل از آن در تشخیص غلظت‌های بسیار کم DNA استوار است. مناسب بودن هر یک از این روش‌ها عمدتاً به غلظت و خلوص نمونه بستگی دارد؛ در بسیاری از موارد، حتی ممکن است توصیه شود که هر دو روش به طور موازی اعمال شوند.