Teorian txantiloiaren molekula bat nahikoa izango litzatekeen arren, DNA kantitate askoz handiagoak erabiltzen dira PCR klasiko baterako, adibidez, ugaztunen DNA genomiko 1 µg-raino eta plasmido DNA 1 pg-raino. Kopuru optimoa neurri handi batean helburu-sekuentziaren kopia kopuruaren eta bere konplexutasunaren araberakoa da.
Txantiloi gutxi erabiltzen bada, anplifikazio ziklo kopurua handitu beharko da produktu kopuru nahikoa lortzeko. PCR esperimentu gehienetan erabiltzen den Taq polimerasa batek ez du zuzenketa funtziorik (3′-5′ exonukleasa jarduera); beraz, anplifikazioan zehar gertatzen diren akatsak ezin dira zuzendu. Ziklo kopurua zenbat eta handiagoa izan, orduan eta ohikoagoa izango da produktu akastunaren anplifikazioa. Bestalde, txantiloi kopurua altuegia bada, primerrak beste sekuentzia batzuekin (ez ehuneko ehun osagarriekin) elkartzeko probabilitatea, baita primer dimeroak eratzeko probabilitatea ere, handitu egingo da, eta horrek azpiproduktuen anplifikazioa eragingo du. Kasu askotan, DNA zelula-kulturetatik edo mikroorganismoetatik isolatzen da eta ondoren PCR txantiloi gisa erabiltzen da. Purifikatu ondoren, DNAren kontzentrazioa zehaztu behar da PCR konfiguraziorako behar den bolumena definitu ahal izateko. Agarosa gel elektroforesiak estimazio bat emateko balio dezakeen arren, metodo hau ez dago batere zehatza. UV-Vis espektrofotometria azido nukleikoak kuantifikatzeko urrezko estandar gisa ezarri da; Metodo zuzen eta, beraz, erraz eta azkar honek laginaren xurgapena neurtzen du 260 nm-tan, eta kontzentrazioa bihurketa-faktore baten laguntzaz kalkulatzen da.
DNAren kontzentrazioa oso baxua bada, ordea (< 1 µg/mL dsDNA), edo 260 nm-ko tartean xurgatzen duten substantziekin kutsatuta badago (adibidez, RNA, proteina, gatzak), metodo honek bere mugak gaindituko ditu. Kontzentrazio oso baxuen kasuan, irakurketak laster zehaztugabeak bihurtuko dira erabilgarriak izateko, eta kutsadurek benetako balioaren gehiegizko estimazioa (batzuetan izugarria) ekarriko dute. Kasu honetan, fluoreszentzia erabiliz kuantifikatzeak alternatiba bat izan daiteke. Teknika hau dsDNAri espezifikoki lotzen zaion koloratzaile fluoreszente baten erabileran oinarritzen da; azido nukleikoa eta koloratzailea osatzen duten konplexua bakarrik kitzikatzen da argiak, eta ondoren uhin-luzera apur bat handiagoa duen argia igorriko du. Kasu honetan, seinale fluoreszentearen intentsitatea DNA kantitatearekiko proportzionala da, eta kontzentrazioa zehazteko, kurba estandar baten arabera ebaluatzen da. Metodo honen abantailak loturaren espezifikotasunean datza, kutsadurak eragindako kanpoko eraginak baztertzen dituena, baita DNAren kontzentrazio oso baxuak detektatzeko gaitasunean ere. Metodo bakoitzaren egokitasuna batez ere laginaren kontzentrazioaren eta purutasunaren araberakoa da; kasu askotan komenigarria ere izan daiteke bi metodoak paraleloan aplikatzea.
Argitaratze data: 2022ko azaroaren 30a