Kuigi teoreetiliselt piisaks ühest matriitsi molekulist, kasutatakse klassikalise PCR-i jaoks tavaliselt oluliselt suuremaid DNA koguseid, näiteks kuni 1 µg genoomset imetaja DNA-d ja nii vähe kui 1 pg plasmiidset DNA-d. Optimaalne kogus sõltub suuresti sihtjärjestuse koopiate arvust ja selle keerukusest.
Kui kasutatakse väga vähe matriitsi, on piisava produktikoguse saamiseks vaja vastavalt suurendada amplifikatsioonitsüklite arvu. Enamikus PCR-katsetes kasutataval Taq polümeraasil puudub korrektsioonifunktsioon (3′-5′ eksonukleaasi aktiivsus); seega ei saa amplifikatsiooni ajal tekkivaid vigu parandada. Mida suurem on tsüklite arv, seda levinum on vigase produkti amplifikatsioon. Kui aga matriitsi kogus on liiga suur, suureneb praimerite anniilimise tõenäosus teiste (mitte sajaprotsendiliselt komplementaarsete) järjestustega, samuti praimeri dimeeride moodustumise tõenäosus, mis põhjustab kõrvalproduktide amplifikatsiooni. Paljudel juhtudel eraldatakse DNA rakukultuuridest või mikroorganismidest ja seejärel kasutatakse PCR-matriitsina. Pärast puhastamist on vaja määrata DNA kontsentratsioon, et oleks võimalik määratleda PCR-i seadistamiseks vajalik maht. Kuigi agaroosgeelelektroforees võib anda hinnangu, pole see meetod kaugeltki täpne. UV-Vis spektrofotomeetria on loodud nukleiinhapete kvantifitseerimise kuldstandardiks; See otsene ja seetõttu lihtne ning kiire meetod mõõdab proovi neeldumist lainepikkusel 260 nm ja kontsentratsioon arvutatakse teisendusteguri abil.
Kui DNA kontsentratsioon on aga väga madal (< 1 µg/ml dsDNA-d) või kui see on saastunud ainetega, mis neelavad samuti 260 nm vahemikus (nt RNA, valk, soolad), jõuab see meetod oma piirideni. Väga madalate kontsentratsioonide korral muutuvad näidud peagi liiga ebatäpseks, et neid kasutada, ja saastumine viib tegeliku väärtuse (mõnikord tohutu) ülehindamiseni. Sellisel juhul võib alternatiiviks olla fluorestsentsi abil kvantifitseerimine. See meetod põhineb fluorestsentsvärvi kasutamisel, mis seondub spetsiifiliselt dsDNA-ga – ainult nukleiinhappest ja värvainest koosnev kompleks ergastab valgusega ja seejärel kiirgab see veidi kõrgema lainepikkusega valgust. Siin on fluorestsentssignaali intensiivsus proportsionaalne DNA hulgaga ja kontsentratsiooni määramiseks hinnatakse seda standardkõvera suhtes. Selle meetodi eelised seisnevad sideme spetsiifilisuses, mis välistab saastumisest tulenevad välised mõjud, samuti sellest tulenevas võimes tuvastada väga madalaid DNA kontsentratsioone. Mõlema meetodi sobivus sõltub peamiselt proovi kontsentratsioonist ja puhtusest; paljudel juhtudel võib olla isegi soovitatav mõlemat meetodit paralleelselt rakendada.
Postituse aeg: 30. november 2022