Aunque, en teoría, una molécula de la plantilla sería suficiente, para una PCR clásica se suelen utilizar cantidades considerablemente mayores de ADN; por ejemplo, hasta 1 µg de ADN genómico de mamíferos y tan solo 1 pg de ADN plasmídico. La cantidad óptima depende en gran medida del número de copias de la secuencia diana, así como de su complejidad.
Si se utiliza muy poca plantilla, se requerirá un aumento correspondiente en el número de ciclos de amplificación para obtener una cantidad suficiente de producto. La polimerasa Taq, utilizada en la mayoría de los experimentos de PCR, no cuenta con una función de corrección (actividad de exonucleasa 3'-5'); por lo tanto, los errores que ocurren durante la amplificación no pueden corregirse. Cuanto mayor sea el número de ciclos, mayor será la prevalencia de la amplificación de productos defectuosos. Si, por el contrario, la cantidad de plantilla es demasiado alta, aumentará la probabilidad de que los cebadores se alineen con otras secuencias (no totalmente complementarias), así como la formación de dímeros de cebadores, lo que resultará en la amplificación de subproductos. En muchos casos, el ADN se aísla de cultivos celulares o microorganismos y posteriormente se utiliza como plantilla para la PCR. Tras la purificación, es necesario determinar la concentración de ADN para definir el volumen necesario para la configuración de la PCR. Si bien la electroforesis en gel de agarosa puede proporcionar una estimación, este método dista mucho de ser preciso. La espectrofotometría UV-Vis se ha establecido como el estándar de oro para la cuantificación de ácidos nucleicos; este método directo y por lo tanto fácil y rápido mide la absorbancia de la muestra a 260 nm y la concentración se calcula con la ayuda de un factor de conversión.
Sin embargo, si la concentración de ADN es muy baja (<1 µg/mL de dsADN) o si está contaminado con sustancias que también absorben en el rango de 260 nm (p. ej., ARN, proteínas, sales), este método presenta limitaciones. En caso de concentraciones muy bajas, las lecturas se vuelven rápidamente demasiado imprecisas para ser útiles, y las contaminaciones conducen a una sobreestimación (a veces considerable) del valor real. En este caso, la cuantificación mediante fluorescencia puede ser una alternativa. Esta técnica se basa en el uso de un colorante fluorescente que se une específicamente al dsADN; solo el complejo compuesto por el ácido nucleico y el colorante se excita con la luz, emitiendo posteriormente luz con una longitud de onda ligeramente superior. En este caso, la intensidad de la señal fluorescente es proporcional a la cantidad de ADN y, para determinar la concentración, se evalúa en relación con una curva estándar. Las ventajas de este método residen en la especificidad de la unión, que excluye las influencias externas introducidas por la contaminación, así como en la capacidad resultante para detectar concentraciones muy bajas de ADN. La idoneidad de uno u otro método depende principalmente de la concentración y la pureza de la muestra; en muchos casos incluso puede ser aconsejable aplicar ambos métodos en paralelo.
Hora de publicación: 30 de noviembre de 2022