Kvankam teorie unu molekulo de la ŝablono sufiĉus, konsiderinde pli grandaj kvantoj de DNA estas tipe uzataj por klasika PCR, ekzemple, ĝis 1 µg de genoma mamula DNA kaj eĉ nur 1 pg de plasmida DNA. La optimuma kvanto dependas plejparte de la nombro da kopioj de la cela sekvenco, same kiel de ĝia komplekseco.
Se tre malmulte da ŝablono estas uzata, koresponda pliiĝo en la nombro da amplifikaj cikloj estos necesa por akiri sufiĉan kvanton da produkto. Taq-polimerazo, kiu estas uzata por la plej multaj PCR-eksperimentoj, ne havas korektan funkcion (3′-5′ eksonucleaza agado); tial, eraroj okazantaj dum amplifikado ne povas esti korektitaj. Ju pli alta la nombro da cikloj, des pli ofta estos la amplifikado de mankhava produkto. Aliflanke, se la kvanto de ŝablono estas tro alta, la probableco de enkondukoj kuniĝas kun aliaj (ne centprocente komplementaj) sekvencoj, same kiel la formado de enkondukaj dimeroj, pliiĝos, kio rezultigos la amplifikadon de kromproduktoj. En multaj kazoj, DNA estas izolita de ĉelkulturoj aŭ de mikroorganismoj kaj poste uzata kiel PCR-ŝablono. Post purigo, necesas determini la koncentriĝon de la DNA por povi difini la volumenon, kiu estas bezonata por la PCR-aranĝo. Dum agaroza ĝelelektroforezo povas servi por provizi takson, ĉi tiu metodo estas malproksima de preciza. UV-Vis-spektrofotometrio estis establita kiel la ora normo por la kvantigado de nukleaj acidoj; ĉi tiu rekta kaj tial facila kaj rapida metodo mezuras la absorbadon de la specimeno je 260 nm, kaj la koncentriĝo estas kalkulata per helpo de konverta faktoro.
Se la DNA-koncentriĝo estas tre malalta, tamen (< 1 µg/mL dsDNA), aŭ se ĝi estas poluita per substancoj, kiuj ankaŭ absorbiĝas en la 260 nm-intervalo (ekz. RNA, proteino, saloj), ĉi tiu metodo atingos siajn limojn. Ĉe tre malaltaj koncentriĝoj, la legaĵoj baldaŭ fariĝos tro malprecizaj por esti utilaj, kaj poluadoj kondukos al (foje grandega) supertakso de la efektiva valoro. En ĉi tiu kazo, kvantigo per fluoresko povas prezenti alternativon. Ĉi tiu tekniko baziĝas sur la uzo de fluoreska tinkturfarbo, kiu specife ligiĝas al dsDNA - nur la komplekso konsistanta el nuklea acido kaj tinkturfarbo estas ekscitita de la lumo, kaj ĝi poste elsendos lumon de iomete pli alta ondolongo. Ĉi tie, la intenseco de la fluoreska signalo estas proporcia al la kvanto de DNA, kaj por determini la koncentriĝon ĝi estas taksata rilate al norma kurbo. La avantaĝoj de ĉi tiu metodo baziĝas sur la specifeco de la ligo, kiu ekskludas la eksterajn influojn enkondukitajn de poluado, same kiel sur la rezulta kapablo detekti tre malaltajn koncentriĝojn de DNA. La taŭgeco de ambaŭ metodoj dependas ĉefe de la specimena koncentriĝo kaj pureco; en multaj kazoj povas eĉ esti konsilinde apliki ambaŭ metodojn paralele.
Afiŝtempo: 30-a de novembro 2022