Obwohl theoretisch ein Molekül der Vorlage ausreichen würde, werden für eine klassische PCR typischerweise deutlich größere DNA-Mengen verwendet, beispielsweise bis zu 1 µg genomischer Säugetier-DNA und nur 1 pg Plasmid-DNA. Die optimale Menge hängt maßgeblich von der Kopienzahl der Zielsequenz sowie deren Komplexität ab.
Wird nur wenig Template verwendet, erhöht sich die Anzahl der Amplifikationszyklen entsprechend, um eine ausreichende Produktmenge zu erhalten. Die für die meisten PCR-Experimente verwendete Taq-Polymerase verfügt nicht über eine Korrekturfunktion (3′-5′-Exonuklease-Aktivität); daher können während der Amplifikation auftretende Fehler nicht korrigiert werden. Je höher die Zyklenzahl, desto häufiger kommt es zur Amplifikation fehlerhafter Produkte. Ist die Template-Menge hingegen zu hoch, steigt die Wahrscheinlichkeit der Anlagerung von Primern an andere (nicht hundertprozentig komplementäre) Sequenzen sowie der Bildung von Primerdimeren, was zur Amplifikation von Nebenprodukten führt. Häufig wird DNA aus Zellkulturen oder Mikroorganismen isoliert und anschließend als PCR-Template verwendet. Nach der Aufreinigung muss die DNA-Konzentration bestimmt werden, um das für den PCR-Aufbau benötigte Volumen festzulegen. Die Agarosegelelektrophorese kann zwar eine Abschätzung liefern, ist aber alles andere als genau. Die UV-Vis-Spektrophotometrie hat sich als Goldstandard für die Quantifizierung von Nukleinsäuren etabliert. Bei dieser direkten und daher einfachen und schnellen Methode wird die Absorption der Probe bei 260 nm gemessen und die Konzentration mithilfe eines Umrechnungsfaktors berechnet.
Bei sehr geringen DNA-Konzentrationen (< 1 µg/mL dsDNA) oder Verunreinigungen mit Substanzen, die ebenfalls im 260-nm-Bereich absorbieren (z. B. RNA, Proteine, Salze), stößt diese Methode jedoch an ihre Grenzen. Bei sehr geringen Konzentrationen werden die Messwerte schnell zu ungenau, und Verunreinigungen führen zu einer (teilweise enormen) Überschätzung des tatsächlichen Wertes. In diesem Fall kann die Quantifizierung mittels Fluoreszenz eine Alternative darstellen. Diese Technik basiert auf der Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffs, der spezifisch an dsDNA bindet. Erst der Komplex aus Nukleinsäure und Farbstoff wird durch das Licht angeregt und emittiert anschließend Licht einer etwas höheren Wellenlänge. Die Intensität des Fluoreszenzsignals ist dabei proportional zur DNA-Menge und wird zur Konzentrationsbestimmung im Verhältnis zu einer Standardkurve ausgewertet. Die Vorteile dieser Methode liegen in der Spezifität der Bindung, die äußere Einflüsse durch Verunreinigungen ausschließt, sowie in der daraus resultierenden Fähigkeit, sehr geringe DNA-Konzentrationen zu detektieren. Die Eignung der einen oder anderen Methode hängt hauptsächlich von der Konzentration und Reinheit der Probe ab; in vielen Fällen kann es sogar ratsam sein, beide Methoden parallel anzuwenden.
Veröffentlichungszeit: 30. November 2022