Tot i que en teoria una molècula de la plantilla seria suficient, normalment s'utilitzen quantitats d'ADN considerablement més grans per a una PCR clàssica, per exemple, fins a 1 µg d'ADN genòmic de mamífer i tan sols 1 pg d'ADN plasmídic. La quantitat òptima depèn en gran mesura del nombre de còpies de la seqüència diana, així com de la seva complexitat.
Si s'utilitza molt poca plantilla, caldrà un augment corresponent en el nombre de cicles d'amplificació per obtenir una quantitat suficient de producte. Una Taq polimerasa que s'utilitza per a la majoria d'experiments de PCR no presenta una funció de correcció (activitat exonucleasa 3'-5'); per tant, els errors que es produeixen durant l'amplificació no es poden corregir. Com més alt sigui el nombre de cicles, més prevalent serà l'amplificació del producte defectuós. Si, en canvi, la quantitat de plantilla és massa alta, augmentarà la probabilitat que els encebadors s'uneixin a altres seqüències (no complementàries al cent per cent), així com la formació de dímers d'encebadors, cosa que provocarà l'amplificació de subproductes. En molts casos, l'ADN s'aïlla de cultius cel·lulars o de microorganismes i posteriorment s'utilitza com a plantilla de PCR. Després de la purificació, cal determinar la concentració de l'ADN per poder definir el volum necessari per a la configuració de la PCR. Tot i que l'electroforesi en gel d'agarosa pot servir per proporcionar una estimació, aquest mètode està lluny de ser precís. L'espectrofotometria UV-Vis s'ha establert com l'estàndard d'or per a la quantificació d'àcids nucleics; Aquest mètode directe i, per tant, fàcil i ràpid mesura l'absorbància de la mostra a 260 nm i la concentració es calcula amb l'ajuda d'un factor de conversió.
Si la concentració d'ADN és molt baixa, però (< 1 µg/mL d'ADN bicatenari) o si està contaminat amb substàncies que també absorbeixen en el rang de 260 nm (per exemple, ARN, proteïnes, sals), aquest mètode arribarà a les seves limitacions. En el cas de concentracions molt baixes, les lectures aviat es tornaran massa inexactes per ser útils, i les contaminacions conduiran a una sobreestimació (de vegades enorme) del valor real. En aquest cas, la quantificació mitjançant fluorescència pot presentar una alternativa. Aquesta tècnica es basa en l'ús d'un colorant fluorescent que s'uneix específicament a l'ADN bicatenari; només el complex que comprèn l'àcid nucleic i el colorant s'excita amb la llum i, posteriorment, emetrà llum d'una longitud d'ona lleugerament superior. Aquí, la intensitat del senyal fluorescent és proporcional a la quantitat d'ADN i, per determinar la concentració, s'avalua en relació amb una corba estàndard. Els avantatges d'aquest mètode resideixen en l'especificitat de l'enllaç, que exclou les influències externes introduïdes per la contaminació, així com en la capacitat resultant de detectar concentracions molt baixes d'ADN. L'adequació de qualsevol dels dos mètodes depèn principalment de la concentració i la puresa de la mostra; en molts casos fins i tot pot ser aconsellable aplicar tots dos mètodes en paral·lel.
Data de publicació: 30 de novembre de 2022