Iako bi u teoriji jedna molekula kalupa bila dovoljna, za klasičnu PCR se obično koriste znatno veće količine DNK, na primjer, do 1 µg genomske DNK sisara i samo 1 pg plazmidne DNK. Optimalna količina uveliko zavisi od broja kopija ciljne sekvence, kao i od njene složenosti.
Ako se koristi vrlo malo predloška, bit će potrebno odgovarajuće povećanje broja ciklusa amplifikacije da bi se dobila dovoljna količina produkta. Taq polimeraza koja se koristi za većinu PCR eksperimenata nema funkciju korekcije (3′-5′ egzonukleazna aktivnost); stoga se greške koje se javljaju tokom amplifikacije ne mogu ispraviti. Što je veći broj ciklusa, to će amplifikacija neispravnog produkta biti češća. S druge strane, ako je količina predloška prevelika, vjerovatnoća vezivanja prajmera za druge (ne sto posto komplementarne) sekvence, kao i formiranje dimera primera, će se povećati, što će rezultirati amplifikacijom nusprodukata. U mnogim slučajevima, DNK se izoluje iz ćelijskih kultura ili iz mikroorganizama i potom koristi kao PCR predložak. Nakon prečišćavanja, potrebno je odrediti koncentraciju DNK kako bi se mogao definirati volumen koji je potreban za PCR postavku. Iako elektroforeza na agaroznom gelu može poslužiti za procjenu, ova metoda je daleko od tačne. UV-Vis spektrofotometrija je uspostavljena kao zlatni standard za kvantifikaciju nukleinskih kiselina; Ova direktna, a samim tim jednostavna i brza metoda mjeri apsorbanciju uzorka na 260 nm, a koncentracija se izračunava uz pomoć faktora konverzije.
Međutim, ako je koncentracija DNK vrlo niska (< 1 µg/mL dsDNK), ili ako je kontaminirana supstancama koje također apsorbiraju u rasponu od 260 nm (npr. RNK, protein, soli), ova metoda će dostići svoja ograničenja. U slučaju vrlo niskih koncentracija, očitanja će uskoro postati previše netačna da bi bila upotrebljiva, a kontaminacije će dovesti do (ponekad ogromnog) precjenjivanja stvarne vrijednosti. U ovom slučaju, kvantifikacija pomoću fluorescencije može predstavljati alternativu. Ova tehnika se zasniva na upotrebi fluorescentne boje koja se specifično veže za dsDNK - samo kompleks koji sadrži nukleinsku kiselinu i boju pobuđuje se svjetlošću, a on će potom emitovati svjetlost nešto veće talasne dužine. Ovdje je intenzitet fluorescentnog signala proporcionalan količini DNK, a za određivanje koncentracije se procjenjuje u odnosu na standardnu krivulju. Prednosti ove metode leže u specifičnosti veze, koja isključuje vanjske utjecaje uzrokovane kontaminacijom, kao i u rezultirajućoj sposobnosti detekcije vrlo niskih koncentracija DNK. Prikladnost bilo koje metode uglavnom zavisi od koncentracije i čistoće uzorka; U mnogim slučajevima čak može biti preporučljivo primijeniti obje metode paralelno.
Vrijeme objave: 30. novembar 2022.