যদিও তত্ত্ব অনুসারে, টেমপ্লেটের একটি অণুই যথেষ্ট হবে, তবুও একটি ক্লাসিক পিসিআর-এর জন্য সাধারণত যথেষ্ট পরিমাণে ডিএনএ ব্যবহার করা হয়, উদাহরণস্বরূপ, 1 µg পর্যন্ত জিনোমিক স্তন্যপায়ী ডিএনএ এবং 1 pg পর্যন্ত প্লাজমিড ডিএনএ। সর্বোত্তম পরিমাণ মূলত লক্ষ্য ক্রমের কপির সংখ্যার উপর, সেইসাথে এর জটিলতার উপর নির্ভর করে।
যদি খুব কম টেমপ্লেট ব্যবহার করা হয়, তাহলে পর্যাপ্ত পরিমাণে পণ্য পেতে পরিবর্ধন চক্রের সংখ্যা বৃদ্ধির প্রয়োজন হবে। বেশিরভাগ পিসিআর পরীক্ষার জন্য ব্যবহৃত একটি টাক পলিমারেজ সংশোধন ফাংশন (3′-5′ এক্সোন্যুক্লিজ কার্যকলাপ) বৈশিষ্ট্যযুক্ত নয়; অতএব, পরিবর্ধনের সময় ঘটে যাওয়া ত্রুটিগুলি সংশোধন করা যায় না। চক্রের সংখ্যা যত বেশি হবে, ত্রুটিপূর্ণ পণ্যের পরিবর্ধন তত বেশি হবে। অন্যদিকে, যদি টেমপ্লেটের পরিমাণ খুব বেশি হয়, তাহলে প্রাইমারগুলি অন্যান্য (একশ শতাংশ পরিপূরক নয়) ক্রমগুলিতে অ্যানিলিংয়ের সম্ভাবনা বৃদ্ধি পাবে, সেইসাথে প্রাইমার ডাইমার তৈরি হবে, যার ফলে উপ-পণ্যগুলির পরিবর্ধন হবে। অনেক ক্ষেত্রে, ডিএনএ কোষ সংস্কৃতি বা অণুজীব থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয় এবং পরবর্তীতে পিসিআর টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহৃত হয়। পরিশোধনের পরে, পিসিআর সেটআপের জন্য প্রয়োজনীয় আয়তন নির্ধারণ করতে সক্ষম হওয়ার জন্য ডিএনএর ঘনত্ব নির্ধারণ করা প্রয়োজন। যদিও অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস একটি অনুমান প্রদান করতে পারে, এই পদ্ধতিটি সঠিক নয়। নিউক্লিক অ্যাসিডের পরিমাণ নির্ধারণের জন্য UV-Vis স্পেকট্রোফটোমেট্রি স্বর্ণমান হিসেবে প্রতিষ্ঠিত হয়েছে; এই সরাসরি এবং তাই সহজ এবং দ্রুত পদ্ধতিটি 260 nm-এ নমুনার শোষণ পরিমাপ করে এবং ঘনত্ব একটি রূপান্তর ফ্যাক্টরের সাহায্যে গণনা করা হয়।
তবে, যদি ডিএনএ ঘনত্ব খুব কম হয় (< 1 µg/mL dsDNA), অথবা যদি এটি এমন পদার্থ দ্বারা দূষিত হয় যা 260 nm পরিসরে শোষণ করে (যেমন RNA, প্রোটিন, লবণ), তাহলে এই পদ্ধতিটি তার সীমাবদ্ধতায় পৌঁছে যাবে। খুব কম ঘনত্বের ক্ষেত্রে, রিডিংগুলি শীঘ্রই ব্যবহারের জন্য এতটাই ভুল হয়ে যাবে এবং দূষণের ফলে প্রকৃত মানের (কখনও কখনও বিশাল) অতিরঞ্জিততা দেখা দেবে। এই ক্ষেত্রে, ফ্লুরোসেন্স ব্যবহার করে পরিমাণ নির্ধারণ একটি বিকল্প উপস্থাপন করতে পারে। এই কৌশলটি একটি ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জক ব্যবহারের উপর ভিত্তি করে তৈরি করা হয়েছে যা বিশেষভাবে dsDNA-এর সাথে আবদ্ধ হয় শুধুমাত্র নিউক্লিক অ্যাসিড এবং রঞ্জক সমন্বিত জটিল আলো দ্বারা উত্তেজিত হয় এবং এটি পরবর্তীতে সামান্য উচ্চ তরঙ্গদৈর্ঘ্যের আলো নির্গত করবে। এখানে, ফ্লুরোসেন্ট সংকেতের তীব্রতা ডিএনএর পরিমাণের সমানুপাতিক, এবং ঘনত্ব নির্ধারণের জন্য এটি একটি আদর্শ বক্ররেখার সাথে সম্পর্কিত মূল্যায়ন করা হয়। এই পদ্ধতির সুবিধাগুলি বন্ধনের নির্দিষ্টতার উপর নির্ভর করে, যা দূষণের দ্বারা প্রবর্তিত বাহ্যিক প্রভাবগুলিকে বাদ দেয়, সেইসাথে ডিএনএর খুব কম ঘনত্ব সনাক্ত করার ফলে প্রাপ্ত ক্ষমতার উপরও নির্ভর করে। উভয় পদ্ধতির উপযুক্ততা মূলত নমুনার ঘনত্ব এবং বিশুদ্ধতার উপর নির্ভর করে; অনেক ক্ষেত্রে উভয় পদ্ধতি সমান্তরালভাবে প্রয়োগ করাও যুক্তিযুক্ত হতে পারে।
পোস্টের সময়: নভেম্বর-৩০-২০২২